Гипотезы (кратко)
- Ресурсная нагрузка (translation/transcription/replication): большая доля ресурсов уходит на синтез чужеродного белка/плазмиды.
- Токсичность белка или его продукта: фермент сам или продукт/побочный метаболит вредят клетке.
- Плохая свёртка/агрегация → протеостресс (шоковый ответ, снижение функции).
- Копийность плазмиды / нагрузка на репликацию и поддержание (segregational burden).
- Дисбаланс метаболических потоков (истощение коферментов, накопление токсичных промежуточных).
- Нарушение мембран (если белок мембранный) или нарушенная локализация.
- Кадирование/транслокационная стагнация (codon usage, дефицит тРНК) → замедление синтеза белков.
- Побочные эффекты маркера/антимикробного отбора (антибиотик в среде).
Ключевые измерения и контролы
- Контролы: штамм без плазмиды, штамм с пустой плазмидой, плазмида с инактивным (frameshift) геном фермента.
- Индукция: сравнить с/без индуктора, если используется индуцибельный промотор.
- Повторяемость: минимум $n=3$ биологические повторы.
Экспериментальный план (пошагово, от простого к сложному)
1) Подтверждение эффекта
- Рост в жидкой среде (OD600) и измерение удельной скорости роста $\mu$ для: плазмидный штамм, пустой вектор, плазмидо‑свободный; с/без индуктора.
- Конкурентный фитнесс-ассай: смешать плазмидный и контрольный штаммы в соотношении $1:1$, посчитать изменение долей через $24$–$48$ ч.
Интерпретация: если дефект только при индукции → экспрессия/белок; если и без — платформа/репликация/антибиотик.
2) Уровень экспрессии и копийность
- RT‑qPCR для транскриптов чужеродного гена и house-keeping.
- qPCR для копий плазмиды (копий/хромосома).
- Вестерн-блот / флуоресцентный фьюжн для количества белка.
Интерпретация: высокая экспрессия/копийность → ресурсная нагрузка.
3) Протеиновая солюбильность и стресс
- Фракционирование клеток на растворимую и нерастворимую фракции, SDS‑PAGE/Western.
- Микроскопия (флуоресцентная, если метка) для inclusion bodies.
- Измерение экспрессии шоковых генов (dnaK, groEL, ibpA) RT‑qPCR или протеомика.
Интерпретация: агрегация + повышенные шапероны → плохая свёртка; co‑expression шаперонов как тест.
4) Метаболический профиль и коферменты
- Целевая метаболомика (substrate, product, возможные токсичные промежуточные).
- Измерение АТФ, соотношения NADH/NAD+; уровни ppGpp (стресс голода).
- Тесты на дефицит коферментов (например добавление нутриентов/коферментов и смотреть рост).
Интерпретация: накопление токсина или истощение кофакторов укажет на метаболическую причину.
5) Нагрузка на трансляцию/тРНК
- Полисомный профиль (polysome profiling) или ribosome profiling, чтобы увидеть рибосомную стагнацию.
- Анализ codon usage; искусственные изменения RBS/кодонная оптимизация как тест.
Интерпретация: признаки стагнации → codon bias/дефицит тРНК; ослабление RBS или редизайн CDS должны снизить нагрузку.
6) Генетические и плазмидные модификации (результативные тесты)
- Снижение копийности плазмиды (пересадка в low‑copy backbones) или ослабление промотора/ RBS; сравнить рост.
- Создать неактивный фермент (point mutation) — если рост восстановится, проблема в активности/продукте.
- Ко‑экспрессия шаперонов (GroEL/ES, DnaK) — для проверки свёртки.
- Изменение условий культивирования (температура $30^{\circ }$C vs $37^{\circ }$C), добавление осмо-/хемо‑защитников.
Ожидаемые результаты и их интерпретация (коротко)
- Дефект только при экспрессии и его уменьшение при снижении промотора/копий → ресурсная нагрузка.
- Дефект только при активном ферменте, восстановление при inactivation → токсичность продукта/метаболит.
- Нерастворимый белок + повышенные шапероны + восстановление при co‑expression шаперонов → свёрточный стресс.
- Высокий уровень ppGpp/пониженный ATP → общий энергетический стресс/рециркуляция ресурсов.
- Полисомы с застопоренными рибосомами → codon usage / транслокация проблема.
Практическая последовательность и сроки (ориентировочно)
- Базовые рост/индукция/контролы и plasmid copy/RT‑qPCR: $1-2$ недели.
- Протеиновые анализы (western, солюбильность), inclusion bodies, шапероны: +$1$ неделя.
- Метаболомика/ppGpp/АТФ: +$1-2$ недели.
- Полисомный профиль / Ribo‑seq / протеомика: +$2-4$ недели.
- Итерации с конструкциями (низкокопийный вектор, ослабленный промотор, codon redesign): зависит от клонирования, обычно $2-6$ недель.
Короткие вмешательства для проверки гипотезы (быстро)
- Отменить индукцию (если применимо).
- Пересадить ген в low‑copy backbone или использовать слабый промотор/RBS.
- Сделать frameshift/stop‑контроль.
- Добавить GroEL/GroES ко‑экспрессию.
Подсказка по анализу затрат ресурса (формула для оценки доли протеома)
- Оценить долю протеома, занятую чужеродным белком: $f=\frac{M_{het}}{M_{total}}$, где $M_{het}$ — масса чужеродного белка на клетку, $M_{total}$ — общая белковая масса. Снижение роста часто пропорционально $f$ (приближённо $\Delta \mu \propto f$).
Если нужно, могу дать шаблоны праймеров/описание протоколов (qPCR, полисомный профиль, фракционирование белка) или предложить приоритет экспериментов по доступным ресурсам.