Краткий план эксперимента по нокауту гена развития у Danio rerio (zebrafish) с CRISPR/Cas9, ключевые этапы, критерии успешности и побочные эффекты, которые нужно контролировать.
1) Выбор цели и проектирование
- Выберите функционально важный экзон (ранний кодирующий или консервативная область).
- Спроектируйте несколько sgRNA (рекомендуемо $2$–$4$) по программам (CRISPRscan, CHOPCHOP). Оцените off‑target и выберите sgRNA с минимальным риском (низкий CFD/score).
- План на случай комплементации/резервной функции паралогов.
2) Подготовка материалов
- Два варианта системы:
- mRNA: Cas9 mRNA $300$–$600ng/\mu \mathrm{L}$, sgRNA $50$–$150ng/\mu \mathrm{L}$.
- RNP: Cas9 белок $300$–$1000ng/\mu \mathrm{L}$ + sgRNA в молярном избытке (обычно sgRNA : Cas9 $\approx 2:1$ по молям).
- Инъекционный буфер (например 0.1 M KCl, $0.05\%$ фенолклороформ? — лучше стандартный фильтрованный буфер), добавьте фенолфталеиновый индикатор для визуализации инъекции.
- Подготовьте праймеры для амплификации региона цели и предполагаемых off‑target сайтов.
3) Микроинъекции
- Инъецируйте в зародыш на стадии $1$-cell. Объём инъекции обычно $1$–$2\mathrm{nL}$.
- Количество эмбрионов: для первичной оценки инъектируйте $\ge 100$ эмбрионов на sgRNA/условие.
- Включите контрольные группы: неинъецированные, Cas9-only, sgRNA-only.
4) Первичный анализ мутаций (F0)
- Через $24$–$72$ часа post fertilization (hpf) отберите $\ge 20$ инъецированных эмбрионов для генотипирования.
- Методы: PCR ампликон + Sanger (TIDE/ICE) или ампликонный NGS для точного определения частоты ин/del. Дополнительно HRMA или T7E1 для быстрого скрининга.
- Критерий успешности в F0: суммарная мутационная доля в образце эмбрионов $\ge 50\%$ (мозаичность ожидаема) и/или видимая фенотипическая частота $>30\%$ в зависимости от мутации.
5) Получение стабильной линии (F1/F2)
- Взрослых F0 с высокой соматической/потенциальной герминативной мозаичностью спаривайте с WT. Проверьте $\ge 20$–$50$ потомков каждого F0 на присутствие аллелей (PCR + секвенирование).
- Отберите носителей (F1), интроцируйте и получите гетерозиготы/гомозиготы в F2. Подтвердите рамочный сдвиг/нокаут белка секвенированием и, при возможности, Western blot/IHC для потери белка.
6) Фенотипический анализ
- Оценивайте морфологию и развитие в критические стадии: $24\mathrm{hpf}$, $48\mathrm{hpf}$, $72\mathrm{hpf}$ и далее.
- Методы: световая микроскопия, in situ гибридизация на маркёры тканей, иммуногистохимия, поведенческие тесты (при необходимости).
- Для подтверждения причинности: резкаяция (rescue) фенотипа путем введения WT мРНК, нечувствительной к sgRNA (с silent мутациями) — успешный рескью подтверждает on‑target эффект.
7) Контроль off‑target и структурных побочек
- Предсказанные top $5$–$10$ off‑target сайтов: амплифицируйте и секвенируйте у нескольких F0/F1.
- Проверяйте крупные делеции/реверсивные перестройки: long‑range PCR, опционально WGS в критичных линиях.
- Оцените возможную активацию p53/токсичность (qPCR p53, морфология). Избегайте использования p53 морфолинов как рутинного решения — применяйте только для диагностики.
8) Побочные эффекты и как их контролировать
- Мозаичность F0: решается получением и анализом F1/F2.
- Off‑target мутации: используйте несколько независимых sgRNA, сравните фенотипы; outcross линии $>2$ поколения для удаления ненужных вариантов.
- Генетическая компенсация (up‑regulation паралогов): проверяйте экспрессию потенциальных компенсационных генов (qPCR/RNA‑seq).
- Токсичность/смертность, задержка развития: оптимизируйте дозы Cas9/sgRNA, уменьшите концентрации и объём инъекции; включайте Cas9‑only и buffer controls.
- Хромосомные перестройки/большие делеции: проверяйте long‑range‑PCR и копийное число, особенно если наблюдаются неожиданные фенотипы.
9) Критерии успешности (резюме)
- Эффективность редактирования в F0: мутационная доля в ампликоне $>50\%$ для выбранного sgRNA.
- Наличие передаваемых герминативно инделов в F1 с частотой $>5$% у потомков F0 (в зависимости от мозаичности).
- Устойчивый фенотип у гомозигот F2, который подтверждается рескью и/или независимыми sgRNA.
- Отсутствие значимых off‑target мутаций в критичных генах, подтверждённое секвенированием.
10) Практические рекомендации по контролю качества
- Используйте минимум $2$ независимых sgRNA и сравнивайте фенотипы.
- Поддерживайте реплики: по крайней мере $n=20$–$30$ эмбрионов/условие для статистической оценки фенотипа; для взрослых линий — стандартные биологические реплики.
- Документируйте все последовательности, праймеры, условия инъекции и результаты секвенирования.
Если нужно, могу дать шаблон инъекционного раствора с точными концентрациями для mRNA или RNP и пример PCR‑протокола для скрининга.