Краткая, практическая стратегия (концептуально, без пошаговых рецептов):
1) Цель и требования
- Определите, нужна ли нативная посттрансляционная модификация (гликозилирование, специфические протеолизные события). Если да — E. coli может быть неподходящим; рассмотрите дрожжи/insect/mammalian системы.
- Оцените свойства белка: размер, число и расположение дисульфидных мостов, необходимость кофакторов, наличие гидрофобных/мембранных участков.
2) Выбор вектора/системы (общие критерии)
- Промотор: использовать регулируемую систему, позволяющую снизить скорость экспрессии при проблемах со сворачиванием (например, сильный, но индуцируемый промотор против слабого/умеренного).
- Копийность плазмиды: высокая копийность для максимальной продукции, низкая — для токсичных/трудно сворачивающихся белков.
- Метки/фиксация: добавьте N‑ или C‑терминальный растворимости/аффинности-тег (например, MBP, GST, SUMO, His) с возможностью удалять тег специфической протеазой. Тег помогает очистке и иногда улучшает растворимость.
- Периплазматическая секреция: если нужны дисульфидные мости, рассмотрите сигнальные пептиды для экспорта в периплазму.
(Выбор конкретного вектора следует делать по заданным выше критериям.)
3) Хост‑штамм (общее руководство)
- Для мощной T7‑зависимой экспрессии — штаммы типа BL21(DE3).
- При проблемах с редкими кодонами — штаммы/плазмиды, снабжающие редкими тРНК.
- Для образования дисульфидных связей в цитоплазме — мутантные штаммы с окисляющей средой.
- Для токсичных/плохо сворачивающихся белков — штаммы, модифицированные для уменьшения протеолиза или снижения скорости синтеза.
4) Оптимизация кодонов (концептуально)
- Цель: адаптировать кодонное использование к хозяину, избегая массового накопления редких кодонов и чрезмерных повторов, но не «переписать» mRNA до монотонности.
- Критерии при оптимизации:
- целевой индекс адаптации (CAI) близок к $\approx 0.8\text{–}1.0$ (все числовые ориентиры — качественные);
- GC‑содержание в разумных пределах для E. coli, например $\approx 40\%\text{–}60\%$;
- убрать внутренние сайты рестрикции, сильные мотивы для воздействия на транскрипцию/трансляцию (например, преждевременные терминаторы), и избыточные однотипные повторы;
- минимизировать стабильные вторичные структуры mRNA в 5′‑конце (около старт‑кодона/RBS), чтобы не блокировать инициацию трансляции.
- Не следует: полностью «устранить» все редкие кодоны без учета скорости сворачивания — в некоторых случаях редкие кодоны полезны для поэтапного сворачивания.
5) Проблемы сворачивания и общие решения (концептуально)
- Проблема: образование inclusion bodies (нерастворимые агрегаты). Возможные подходы (в порядке «мягкости»):
- уменьшить скорость синтеза (использовать более слабый/регулируемый промотор или понизить скорость трансляции через синтаксическое изменение мРНК/кодонов);
- использовать N‑ или C‑терминальные растворяющие теги (MBP, NusA, SUMO) с возможностью удаления;
- соэкспрессия шаперонов (GroEL/ES, DnaK/DnaJ/GrpE, trigger factor) — концептуально помогает правильно свернуть сложные белки;
- направить экспрессию в периплазму или использовать штаммы с окисляющей цитоплазмой для образования дисульфидных мостов;
- добавление соответствующих кофакторов/металлов в среду или при очистке (если белок требует кофермента) — концептуально улучшает сворачивание и стабильность;
- рефолдинг in vitro из inclusion bodies как крайняя мера (требует разработки условий выполнимо вне данного плана).
- Проблема: протеолиз/нестабильность — использовать протеазо‑дефицитные штаммы, N‑/C‑концевые теги, хранение в стабилизирующих буферах.
- Проблема: отсутствие нужных PTM — переключиться на соответствующую экспрессионную систему (дрожжи, насекомые, млекопитающие).
6) Дизайн конструкта — практические замечания (без протоколов)
- Включите стабильный RBS и опционально оптимизированный 5′‑некодирующий участок; избегайте сильно стабильных локальных вторичных структур у старт‑кодона.
- Предусмотрите сайты для быстрой проверки последовательности и для вырезания тега (условный сайти для протеазы), а также уникальные рестрикционные/гомологичные участки для клонирования.
- Сохраняйте фрейм и избегайте спаев, меняющих структуру белка.
7) Контроль и аналитика (концептуально)
- Подтверждение последовательности плазмиды (сопоставление с ориг. последовательностью).
- Оценка уровня экспрессии и растворимости (разделение растворимой/нерастворимой фракции и анализ).
- Подтверждение идентичности (иммуноблот, масс‑спектрометрия) и функциональная активность (ферментативный анализ).
- Оценка потребности в дополнительной оптимизации (шапероны, теги, штамм, смена хоста).
8) Рекомендуемая маршрутизация (резюме)
- Если требуется только ферментативная активность без сложных PTM: начать с регулируемой высоко‑производительной системы в E. coli с растворяющим тегом и опцией co‑expression шаперонов; параллельно оптимизировать кодоны, не убирая все редкие кодоны; при проблемах со сворачиванием — перейти на альтернативные штаммы (редкие тРНК, окисляющая цитоплазма) или на eukaryotic hosts если PTM критичны.
Если нужно, могу кратко перечислить плюсы/минусы конкретных тегов и штаммов (без протокольных деталей).