Кратко — возможные причины низкой экспрессии и практические стратегии для улучшения.
Возможные причины
- Низкая транскрипция: слабый промотор/некорректный оператор, низкая копия плазмиды, отсутствие индуктора или репрессия.
- Плохая инициация трансляции: слабый/неправильный RBS, неверный старт-кодон/рамка считывания, неблагоприятная вторичная структура мРНК вокруг RBS/старт-кодона.
- Несовпадение кодонов: частые редкие кодоны для E. coli → торможение трансляции/обрыв.
- Нестабильная мРНК: быстрое разложение из-за некорректного 5' или 3' конца, отсутствие терминатора.
- Белок токсичен для клетки → снижение роста, потеря плазмиды или подавление экспрессии.
- Белок неправильно сворачивается → образование inclusion bodies или деградация протеазами.
- Нужны эукариотические ПТМ (гликозилирование, специфические протеазы) или дисульфидные связи, невозможные в цитозоле E. coli.
- Мутации/рамочные сдвиги/интроны в клонированном фрагменте (человеческие гены часто содержат интроны).
- Неправильный вектор/штамм хозяина (отсутствие необходимых tRNA, окислительных условий и т.д.).
Стратегии повышения экспрессии (практические шаги)
1. Проверка конструкции и последовательности
- Секвенировать плазмиду, проверить отсутствие мутаций/интронов и правильную рамку.
- Убедиться в наличии сильного промотора и RBS перед старт-кодоном.
2. Улучшить транскрипцию/копию плазмиды
- Использовать вектор с сильным промотором (T7, tac, PBAD) или повышенной копией.
- Подобрать подходящий хост (например BL21(DE3) для T7).
3. Оптимизация трансляции
- Оптимизировать RBS и расстояние SD→AUG (обычно $5\text{-}10$ нуклеотидов).
- Проверить/ослабить вторичную структуру мРНК в 5'-UTR (RBS calculator, mFold).
- Кодонная оптимизация для E. coli или использовать штаммы с дополнительными tRNA (Rosetta) для редких кодонов.
4. Снижение токсичности/нагрузки
- Понизить уровень индукции: уменьшить концентрацию индектора (например IPTG до $0.01\text{-}1$ mM) и/или инкубационную температуру.
- Перенести индукцию на более позднюю фазу роста или использовать слабее регулируемые промоторы/автоиндукцию.
5. Улучшение сворачивания и растворимости
- Снизить температуру экспрессии до $15\text{-}25^{\circ }\text{C}$.
- Использовать слияния-фьюжены (MBP, GST, NusA, SUMO) для повышения растворимости; при необходимости удалять тег протеазой.
- Коэкспрессировать шапероны (GroEL/ES, DnaK/DnaJ, Trigger Factor).
- Экспрессировать в периплазме или в окисляющем фоне (штаммы Origami) для дисульфидных связей.
6. Защита от протеаз и стабилизация белка
- Использовать штаммы, дефицитные по протеазам (например Lon-, OmpT-).
- Добавлять ингибиторы протеаз при лизисе; конструировать N-/C‑концевые модификации для стабильности.
7. Альтернативные хосты / системы экспрессии
- Попробовать другие бактерии (например Bacillus), дрожжи (Pichia pastoris), насекомые/маммальные клетки, если требуются ПТМ или специфическая сворачиваемость.
8. Диагностика и мониторинг
- Оценить уровни мРНК (RT-qPCR) и белка (SDS-PAGE, Western blot).
- Проверить плазмидную устойчивость (потеря плазмиды при отсутствии селекции).
- Тестировать ряд условий: температуры, времени индукции, концентрации индектора, разных векторов/штаммов.
Краткая последовательность действий на практике: проверить последовательность → оценить mRNA (структура, RBS) → кодонная оптимизация или Rosetta → смена вектора/промотора/штамма → понижение температуры и титра индектора → фьюжн‑теги/шапероны → при неудаче — менять систему экспрессии.