Вкратце — влияние, рекомендации по валидации и терапевтические направления.
Возможное влияние альтернативного сплайсинга сигнального белка на опухолевую прогрессию
- Изменение функции: утрата/приобретение доменов (каталитического, сайтов связывания, регуляторных) → потеря/активация сигнальной активности (gain- или loss-of-function).
- Сдвиг локализации/секреции: потеря трансмембранного домена → секретируемая форма; изменение ядерной/цитоплазматической локализации → другие эффекты.
- Доминирующий негативный эффект или конститутивная активация: короткие варианты могут блокировать нормальный белок или быть постоянно активными.
- Изменение стабильности и PTM: влияние на убиквитинирование, фосфорилирование → изменение уровня белка и сигналинга.
- Влияние на фенотипы: пролиферация, выживание, миграция/инвазия, ангиогенез, метастазирование, резистентность к терапии, иммунная эвазија.
- Иммунологические и биомаркерные последствия: появление опухоле-специфических неоэпитопов → кандидат для вакцин/Т-клеточной терапии; потенциал диагностического/прогностического маркера.
Ключевые метрики (для отчётности)
- PSI (percent spliced in): $\mathrm{PSI}=\frac{\text{inclusion reads}}{\text{inclusion reads}+\text{skipping reads}}$.
- Лог2-изменение экспрессии: ${\log }_2\mathrm{FC}={\log }_2\frac{{\text{isoform}}_{\text{tumor}}}{{\text{isoform}}_{\text{normal}}}$.
Подходы для валидации (по уровням)
- Биоинформатика (RNA-seq): детекция и квантирование сплайс-изоформ с rMATS/MAJIQ/SUPPA2, визуализация junction reads (IGV), проверка на популяционных данных (GTEx, TCGA).
- Длинные риды: PacBio/ONT для подтверждения полной структуры транскрипта.
- Молекулярно: isoform-specific RT-PCR и Sanger для junction; qPCR с праймерами на уникальные экзон–экзонные сплайсы; цифровая ПЦР при необходимости.
- Белковый уровень: вестерн-блот с антителом, специфичным к уникальному участку, масс-спектрометрия (SRM/PRM) для пептидо-специфичной валидации; иммуноконфокальная микроскопия для локализации.
- Функциональные тесты in vitro: экзогенная экспрессия/siRNA/ASO/CRISPR-exon knockout для оценки эффекта на пролиферацию, апоптоз, миграцию, сигнальный фосфорилирование, reporter assays; minigene-репортер для механистики сплайсинга.
- in vivo: ксенотрансплантаты/PDX/генетические модели (knock-in isoform) для оценки опухолевого роста, метастазирования и реакции на терапию.
- Контроли: нормальные ткани, панель клеток, проверка на splice artifacts, количественная оценка соотношения изоформ.
Терапевтические подходы (стратегии и платформы)
- Сплайсинг-ориентированные: сплайс-меняющие олигонуклеотиды (SSO/ASO) для переключения сплайсинга к нормальной форме или к немощной форме; gapmer для деградации трансскрипта изоформы.
- Таргетирование белка: моноклональные антитела против уникального внешнего эпитопа (если мембранный/секретируемый), маленькомолекулярные ингибиторы против сохранённой доменной функции (например, киназы).
- Уничтожение: PROTAC/молекулы-мостики для деградации специфической изоформы (при наличии уникальной лигандируемой части).
- РНК-интерференция: siRNA/shRNA, при условии высокой специфичности к junction sequence.
- Иммунотерапия: пептидные/мРНК-вакцины или TCR-T/ CAR-T, если есть опухоле-специфические неоэпитопы, представленные MHC.
- Комбинации: таргет на изоформу вместе с ингибированием смежных путей (например, PI3K/MEK), чтобы избежать компенсации.
- Доставка: LNP, галNAc (для печени), вирусные векторы или локальная доставка для опухолей — выбор зависит от ткани и безопасности.
Практические рекомендации и предосторожности
- Сначала подтвердить опухуле-специфичность и отсутствие выражения в жизненно важных нормальных тканях.
- Оценить потенциальные off-target эффекты ASO/siRNA; использовать несколько независимых молекул и rescue-эксперименты.
- Фокусироваться на изоформах с четкой функциональной разницей и возможности селективного таргетирования (уникальная последовательность/эпитоп).
- Для клинической трансляции оценивать иммуногенность, фармакодинамику, биораспределение и токсичность.
Если нужно, могу предложить конкретную валидационную панель экспериментов и приоритетную терапевтическую стратегию для вашего случая (указать, какая информация доступна: секвенирование, наличие изменений в доменах, локализация).