Кратко — какие аргументы и какие данные нужны для оценки безопасности и устойчивости герминативной CRISPR‑терапии.
1) Цели редактирования и биологический контекст — аргументы:
- точная генетическая цель (ген/аллель, механизм патологии, доминантность/рецессивность, плейотропия);
- аргумент о необходимости вмешательства в герминативную линию (альтернативы, соотношение риск/польза);
- цель по изменению (нокаут, исправление замены, внесение варианта) и ожидаемый фенотип.
2) Молекулярные данные (на клеточном уровне) — что измерить и почему:
- эффективность на‑таргета: таргетное глубокое секвенирование локуса (для оценки частоты желаемых реставраций и аллельных исходов);
- off‑target‑анализ genome‑wide: GUIDE‑seq / CIRCLE‑seq / Digenome‑seq / CHANGE‑seq и/или WGS для выявления неожиданных нуклеотидных изменений;
- длинное считывание (PacBio/ONT) и/или структурный анализ (WGS, mate‑pair) — для поиска больших делеций, инверсий, транслокаций и интеграций векторов;
- оценка копийности (ddPCR, CNV‑анализ) — для выявления вставок/удалений;
- одно‑клеточное секвенирование/таргетное секвенирование отдельных зародышевых клеток — для оценки мозаицизма;
- RNA‑seq и протеомика — чтобы увидеть функциональные последствия (непредвиденные изменения экспрессии, шорты транскриптов, фьюжн‑транскрипты);
- эпигенетика (метилирование, хроматиновая конформация) — для возможной стабильности экспрессии;
- маркеры ДНК‑повреждения и ответа на стресс (p53, γH2AX) — чтобы оценить цитотоксичность/онкогенность;
- иммунологические данные: антитела/Т‑клеточный ответ к Cas‑белкам или вектору.
3) Клеточные/эмбриональные данные — что измерить:
- воздействие на развитие эмбриона in vitro (морфология, выживаемость, ранние маркеры дифференцировки);
- временная точка редактирования и тип клетки (зигота vs primordial germ cell vs сперматогония) — влияет на мозаицизм и передаваемость;
- функциональные тесты гамет (подвижность сперматозоидов, ооцитарная плодовитость).
4) Организмные и многопоколенные данные — что измерить:
- в моделях животных — передача правок в потомстве, частота мозаицизма у потомков, фенотипы (физиология, поведение, репродуктивная способность, выживаемость, онкогенность) на протяжении нескольких поколений;
- долгосрочное наблюдение за потомками (море/физиологические отклонения, поздние эффекты);
- биостатистический анализ пенетрации, экспрессии и изменчивости фенотипа.
5) Популяционные и эволюционные аргументы и данные:
- возможные селективные эффекты запускаемого аллеля (модельирование изменения частоты аллеля в популяции, влияние на генетическое разнообразие);
- анализ потенциала плейотропных эффектов и взаимодействий с другими локусами;
- данные о частоте и патогенности целевого варианта в популяционных базах (gnomAD, ClinVar) и прогнозы функциональной значимости (CADD, pLI и др.).
6) Данные по способу доставки и биобезопасности:
- biodistribution и persistence векторного генетического материала (тропизм, остаточные в тканях);
- риск интеграции вектора и анализ сайтов интеграции;
- валидация освобождения/регуляции экспрессии (опциональные выключаемые системы).
7) Контроль качества, репликация и статистика:
- независимые реплики, использование нескольких gRNA и «резервных» стратегий;
- адекватные контролы (неделанные, шерман‑контролы, изогенные линии);
- оценка мощности исследования для обнаружения редких событий: вероятность обнаружения хотя бы одного редкого варианта при частоте $p$ в выборке размера $n$ равна $1-(1-p{)}^n$ — это важно при планировании размера выборки.
8) Юридические, этические и регуляторные данные/аргументы:
- документированное согласие/политика наследования, анализ рисков обществу и последующим поколениям;
- соответствие национальным/международным рекомендациям и предварительные консультации с регуляторами;
- оценка альтернатив и непредвиденных социальных последствий.
Краткая рекомендация по приоритетам измерений: сначала — тщательная валидация on‑ и off‑target (в т.ч. WGS и длинное секвенирование), оценка мозаицизма single‑cell, функциональный и эмбриональный тест, затем многопоколенные животные и моделирование популяционных эффектов.