Возможные причины — кратко и по сути.
Генетические причины
- Внедрение/инсерция нарушила важный ген или регулятор (insertional mutagenesis) — вставка внутри кодирующей последовательности или промотора.
- Позиционный эффект / многокопийность трансгена — неконтролируемая экспрессия или дозовый эффект при копиях > $1$.
- Доминирующий отрицательный аллель или транслокированная хромосомная сегментация (linkage drag) из родительской линии.
- Эпистаз и транcгрессивная сегрегация между гомологами/гомеологами у пшеницы (влияние аллелей A/B/D геномов).
- Офф‑таргетная мутация при использовании редактирования (CRISPR/Cas) и/или сомаклональная вариабельность из культуры тканей.
- Активация транспозонов вследствие трансформации или гибридизации, вызывающая нестабильные фенотипы.
Эпигенетические причины
- Ректрутирование ДНК‑метилирования (RdDM) и РНК‑интерференция: siRNA от трансгена подавляют схожие эндогенные гены.
- Гистоновые модификации и локальная хроматиновая перестройка, приводящие к варьирующей экспрессии (позиционная вариерация).
- Парамутация‑похожие эффекты между аллелями/доместицированными элементами при гибридизации.
- Эпигенетическая нестабильность после регенерации из культуры (вариабельность метилирования).
Практические шаги коррекции программы селекции (последовательность действий)
1) Фенотипирование и наследование: оценить наследование признака в поколениях (F1, F2, BC). Проверить соответствие классическим соотношениям (например, для одного доминантного локуса F2: $3:1$).
2) Молекулярная характеристика трансгенов/линий: определить место вставки и число копий (TAIL‑PCR/Genome walking, long‑read секвенирование, Southern blot или qPCR для определения копий — копийность представить как $1$, $2$ и т.д.).
3) Выражение и sRNA/methylome: RNA‑seq для транскриптома, малые RNA‑seq для siRNA, бисульфит‑секвенирование для профиля метилирования вблизи трансгена и подозрительных эндогенных генов.
4) Исключить офф‑таргеты и сомаклональность: WGS/целевое секвенирование зон, где может быть повреждение; сравнить независимые события трансформации.
5) Стратегия селекции: создать и тестировать несколько независимых событий трансформации и выбирать нейтральные; при необходимости бэктроссинг (backcross) к референтной линии с маркер‑ассистированным отсевом нежелательных локусов. Использовать маркер‑ассистированную селекцию или геномный отбор для удаления linkage drag.
6) Генетическая коррекция: если вставка разрезала ген — либо выбрать другую вставку, либо восстановить функциональность с помощью CRISPR‑редактирования (репарация/комплементация). Если фенотип от гомеологов — редактировать/регулировать все соответствующие гомеологи согласованно.
7) Конструирование трансгена для стабильности: снижать копийность до единичной (однолокусные вставки), использовать тканеспецифичные или индуцируемые промоторы вместо сильных конститутивных, внедрять инсуляторы/MAR‑элементы для снижения позиционных эффектов, целевое внедрение в «safe‑harbor» locus с помощью CRISPR‑HDR.
8) Управление эпигенетикой: выбирать события с устойчивым профилем метилирования; при необходимости повторная селекция линий с стабилизированным экспрессией в нескольких поколениях; избегать чрезмерного использования культивирования соматических клеток (применять альтернативные методы трансформации, например, цветковую трансформацию).
9) Контроль стабильности: мониторить фенотип, экспрессию и эпигеном в нескольких поколениях (минимум $3$ независимые поколения) перед масштабным внедрением.
10) Практические тесты: комплементационные скринов, RNAi/overexpression тесты для определения, вызван ли фенотип подавлением/повышением экспрессии конкретного эндогенного гена; тесты перекрёстного восстановления (complementation).
Ключевые моменты для принятия решений
- Предпочесть несколько независимых событий трансформации и отобрать менее проблемные.
- Если причина генетическая (вставка/мутация) — исправлять через редактирование или отсеять событие.
- Если причина эпигенетическая — отбирать стабильные эпигенетически линии и минимизировать факторы, вызывающие эпигенетическую нестабильность (культура тканей, сильные промоторы, многокопийность, активные ТЭ).
Если нужно, могу кратко описать набор конкретных методов и протоколов для выявления места вставки, анализа копийности, профилирования метилирования и план бэктроссинга для вашей конкретной линии.