Ниже — кратко и по пунктам: что проверить (анализы/маркеры) и какие инженерные решения применять для каждой из четырёх сфер (транскрипция, трансляция, посттрансляции, метаболизм/ферментация).
1) Транскрипция — что исследовать
- Анализы: qPCR / RNA‑seq (уровни мРНК), определение полуразрыва мРНК (тесты на стабильность после ингибирования транскрипции), промоторная активность (репортеры), ChIP для факторів транскрипции/хроматина, splicing/5' и 3' UTR mapping.
- Маркеры/симптомы: пониженная экспрессия при масштабе, переменная экспрессия между клетками, индуцируемый стресс (HAC1 сплайсинг как индикатор UPR).
Инженерные решения
- Тюнинг промотора: заменить на более стабильный/регулируемый (индуцируемый) промотор или снизить силу промотора, чтобы снизить нагрузку в фазе роста.
- Интеграция в геном vs плазмида: интеграция для стабильности или тщательно контролируемая копия на плазмидах; оптимизация количества копий.
- Улучшение стабильности мРНК: оптимизация 5'/3' UTR, удаление деградационных мотивов, добавление stabilizing элементы.
- Эпигенетика: выбирать интеграционные сайты с благоприятной хроматиновой средой (safe‑harbor).
- Управление нагрузкой: использовать промотор, индуцируемый после наращивания биомассы (decouple growth/production).
2) Трансляция — что исследовать
- Анализы: рибосомный профилинг (ribosome profiling) или полисомный анализ, Western/ELISA для белка, анализ стоек по времени (pulse‑chase), исследование 5' UTR/козак‑контекста и структуры мРНК, оценка тРНК‑пула, оценка стояков/стопов на мРНК.
- Маркеры/симптомы: рибосомные стагнации, низкая трансляционная эффективность, агрегирование неполных белков.
Инженерные решения
- Кодонная оптимизация с учётом tRNA‑пула; при необходимости ко‑экспрессия редких tRNA.
- Оптимизация 5'UTR и начального участка CDS (translation ramp) для уменьшения стояков.
- Снижение скорости трансляции для облегчения фолдинга (слабее промотор, уменшение копий, синтаксические изменения).
- Фьюжн‑теги для повышения солубильности/секреции (экз. small solubility tags), или удаление/модификация «плохих» локусов (hydrophobic patches).
- Контроль качества трансляции: усиливать факторы, участвующие в транслокации/разгрузке рибосом при ошибках.
3) Посттрансляционные модификации и секреция — что исследовать
- Анализы: Western + deglycosylation, масс‑спектрометрия для PTM‑карты (N‑/O‑гликозилирование, фосфорилирование), оценки секреции (секретомика), мониторинг ER‑стресса (HAC1 сплайсинг, BiP/Kar2 уровни), pulse‑chase для скорости секреции, определение протеаз в среде.
- Маркеры/симптомы: неправильная или лишняя гликозилизация, задержка в ER, повышенный ERAD, деградация в вакуоли/секр.пространстве, протеолиз в культуре.
Инженерные решения
- Сигнальный пептид: подобрать/оптимизировать prepro‑ сигнал альфа‑фактор или другие сигналы для лучшей секреции; модифицировать фланкирующие участки для корректной Prozesssing.
- Усиление фолдинга/секреторного аппарата: коэкспрессия KAR2/BiP, PDI1, ERO1; усиление рецепторов/секреторных SEC‑генов; активирование адаптивного пути UPR контролируемо (HAC1) для увеличения ёмкости ER.
- Гликозилирование: редактировать сайты N‑glyc (удалять/вводить), humanize glycosylation enzymes (OCH1, mannosyltransferases) если нужно терапевтическое гликопротеиновое соответственно.
- Снижение протеолиза: удалить/понизить PEP4, PRB1 и другие вакуолярные/секреторные протеазы; добавлять ингибиторы протеаз в процесс/оптимизировать pH.
- Минимизировать ERAD/преодолеть удержание: коррекция мутаций/плохого фолдинга, понижение активности ERAD при условии, что не накапливаются токсичные агрегаты.
4) Метаболизм и масштабирование (процесс) — что исследовать
- Анализы: метаболомика, измерение NADPH/NADP+ и ATP, измерение кислорода (OUR/OTR), анализ потоков ${}^{13}C$ MFA, ROS, анализ кислородных/рН/температурных градиентов в биореакторе, сенсорные карты в больших сосудах, cell viability/lysis, секретомика среды.
- Маркеры/симптомы: дефицит предшественников (аминокислот, серы), дефицит NADPH, окислительный стресс, этанол/ацетатный шлейф при перегрузке, снижение жизнеспособности при масштабе.
Инженерные решения
- Перенаправление потоков метаболизма: увеличить поток в ППШ для NADPH (например, overexpression ZWF1/GND), усилить синтез отдельных аминокислот/серосодержащих путей, оптимизация подачи углерода (fed‑batch с контролем скорости роста) для уменьшения overflow.
- Кислород/передача тепла: увеличить аэрацию/мешание, оптимизировать ступенчатый режим (реакторная геометрия, повышение DO), анти‑пена, контролируемое перемешивание.
- Регулирование баланса рост/продукция: применять низкоскоростную подачу углерода или индуцируемые промоторы, снизить удельную скорость роста для повышения специфической продукции.
- Поддержка красоксистемы: увеличение запасов NADPH/глутатиона, антиоксидантные добавки, усиление ферментов восстановления дисульфидов.
- Процессные меры против протеаз и лизиса: мягкий режим перемешивания (уменьшение сдвиговых напряжений), оптимизация pH и температуры, удаление или снижение ауто‑протеаз.
Практическая последовательность действий (рекомендация)
1. Быстрые проверки при масштабе: qPCR, ELISA/Western, viability, DO/OUR, pH, протеазы в среде.
2. Если мРНК низкая — исследовать транскрипцию/стабильность; если мРНК нормальная, но мало белка — рибосомный профилинг/пульс‑чейс.
3. Если белок синтезируется, но не секретируется или деградируется — PTM/секретомика, ER‑стресс маркеры; тесты на протеазную деградацию.
4. Параллельно метаболическая диагностика (метаболомика, NADPH, ${}^{13}C$ MFA) и оптимизация режима ферментации (fed‑batch, DO, pH).
Кратко по приоритету инженерии: сначала устраняйте узкие места секреции/фолдинга (сигнальный пептид, chaperones, удаление протеаз), затем коррекция транскрипции/трансляции (промотор, копии, оптимизация CDS), и параллельно метаболическая поддержка (NADPH, аминокислоты, O2 и режимы подачи). Рассмотрите альтернативный хозяин (Pichia/CHO) при непреодолимых проблемах с PTM/гликозилированием.
Если нужно, могу предложить конкретный набор экспериментов/панелей измерений и примерные гены для модификации для вашей дрожжевой системы (S. cerevisiae или Pichia).