Кратко и по существу.
Сравнение механизмов
- Экзоцитоз: транспорт по секреторному пути ER → компартменты Голджи → секреторные везикулы → прикрепление/докинг (tethers, exocyst), слияние с плазматической мембрамой через SNARE-комплексы (v‑SNARE/VAMP + t‑SNARE/syntaxin + SNAP‑25) и регуляцию малыми GTPазами (Rab8, Rab11 и т.д.). Секретируемые белки могут проходить через конститутивный путь или регулируемый путь (хранятся в гранулах и выделяются по сигналу).
- Эндоцитоз: захват вещества с поверхности клеток в везикулы (клатрин‑зависимый — рецепторный, клатрин‑независимый — кавеолы и др.), отбортовывание/освобождение везикулы зависит от dynamin; последующая маршрутизация в ранние эндосомы (Rab5) → или на рециклинговую траекторию (Rab11) → или в поздние эндосомы/лизосомы (Rab7/LAMP1). Молекулярные шапки (clathrin, adaptor proteins), трафик мембран и липидная композиция критичны.
Возможные клеточные последствия дисфункции экзоцитоза и/или эндоцитоза
- Накопление секретируемых белков в цитоплазме / ER/Golgi: дилатация ER, формирование включений.
- Индукция ER‑стресса и UPR (↑BiP/GRP78, PERK/ATF4, IRE1, ATF6), при длительном — апоптоз (↑CHOP).
- Снижение наружной экспрессии рецепторов/каналов → нарушенная сигнализация и транспорт веществ.
- У эпителиальных клеток — нарушение полярности и барьерной функции, ухудшение секреции муцина/антимикробных пептидов → воспаление и повышенная проницаемость.
- Перегрузка лизосом/автофагии, накопление нерезорбируемых агрегатов (↑p62, изменения LC3).
- Системные последствия в тканях: нарушение гомеостаза, иммунный ответ, дегенерация клеток.
Методы диагностики и экспериментальной верификации (практический рабочий план)
1) Быстрая функциональная проверка секреции
- Сравнить содержание белка в среде и в клеточных лизатах (Western blot, ELISA).
- Использовать секреторные репортеры: Gaussia luciferase или секретируемая щелочная фосфатаза; измерять активность в среде и в клетках.
- Рассчитать эффективность секреции, например: $SE=\frac{S}{S+C}\times 100\%$, где $S$ — белок в среде, $C$ — в клеточном унденатате.
2) Маршрутизация и органелльная локализация
- Иммуфлуоресцентное окрашивание: ER (calnexin, PDI), Golgi (GM130), ранние эндосомы (EEA1, Rab5), рециклинговые (Rab11), лизосомы (LAMP1). Совместная визуализация накопившегося белка.
- Конфокальная/супер‑разрешающая микроскопия; TIRF для визуализации слияний в PM.
3) Динамика трафика
- Pulse‑chase (радиоактивный или click‑chemistry) для оценки скорости выхода из ER и секреции.
- Температурные блоки (например $20^{\circ }\mathrm{C}$ для накопления в Гольджи) и последующее восстановление.
- FRAP/TIRF для регистрации слияний в реальном времени.
4) Ультраструктура
- Электронная микроскопия: дилатированные цистерны ER, накопление везикул, гранул; оценка числа/размера секреторных везикул.
5) Биохимические тесты маршрутизации/созревания
- Анализ гликозилирования (endo‑H vs PNGase F) для определения ретенции в ER или прохождения через Golgi.
- Поверхностная биотинилизация и поточная цитометрия для измерения экспрессии на мембране.
6) Тесты эндоцитоза (если подозрение на дефект и в эндоцитозе)
- Захват трансферрина (рецептор‑опосредованный) или флуоресцентного 70 kDa dextran (пиноцитоз) + кинетика.
- Использование Dynasore или dominant‑negative dynamin (K44A) как контроли.
7) Молекулярные маркеры стресса и деградации
- Western blot / qPCR: BiP, CHOP, spliced XBP1 (UPR); LC3‑I/II, p62 (автофагия); активность протеасомы.
- Тесты на апоптоз (caspase‑3).
8) Генетические и фармакологические манипуляции для картирования блока
- Ингибиторы/перебросы: Brefeldin A (блок ER→Golgi), Monensin (дисфункция Golgi), Bafilomycin A1 (ингибитор V‑ATPase/лизосомы), Dynasore (dynamin).
- Knockdown/overexpression SNARE, Rab, COPII (Sec23/24), tethering factors (exocyst) и наблюдение за восстановлением/усугублением фенотипа.
Рекомендованная последовательность расследования
1) Быстрая оценка секреции (ELISA/репортер) → если ↓,
2) Иммуноколокация с ER/Golgi‑маркерами + Western (lysate vs medium) → определить накопление.
3) Pulse‑chase и endo‑H для локализации блока (ER vs Golgi).
4) EM и маркеры UPR/автофагии для оценки последствий.
5) Фармакологические и генетические вмешательства для идентификации молекулярной причины.
Краткое резюме: накопление секретируемых белков указывает на блок секреции на уровне ER, Golgi или при слиянии в PM; отличить степень и локализацию дефекта помогают комбинации секреционных репортеров, иммуноокраски органелл, pulse‑chase и endo‑H, EM и контрольные ингибиторы; последствия включают ER‑стресс, потерю полярности/барьера у эпителия и активацию деградационных путей.