Кратко, но по существу.
Возможные последствия для структуры и функции белка
- Изменение сплайсинга может приводить к: пропуску экзона, удержанию интрона, использованию криптических 5' / 3' сайтов — в результате появляются несколько изоформ транскрипта.
- Биохимические и структурные эффекты: возникновение рамшифта → преждевременный стоп-кодон (PTC) → укороченные белки или деградация мРНК через NMD; если сдвиг чтения не происходит — удаление/вставка участков, сохраняется рамка → утрата/изменение функциональных доменов, сайтов ПТМ, сигнальных пептидов, сайтов связывания; появление новых пептидных участков → неустойчивость, агрегация, изменённая локализация, потеря/приобретение белково‑белковых или каталитических свойств.
- Фенотипические сценарии: функциональная недостаточность (haploinsufficiency), доминантно‑негативный эффект (токсичные изоформы), гейн‑оф‑функции (новая активность/сигнализация), иммуногенность (необычные пептиды).
Предложение по порядку исследований (in vitro и in vivo)
- Компьютерные предсказания: оценить влияние мутации на сплайсинг (SpliceAI, MaxEntScan, Human Splicing Finder) и на структуру белка (домены, предсказание вторичной/третичной структуры).
- Анализ РНК в клетках пациента / тканях: RT–PCR с праймерами наружу от затронутого экзона, клонирование и секвенирование ампликонов; количественная оценка isoform‑уровней с помощью qPCR и коротко- и длинночтенного RNA‑seq (long‑read — PacBio/ONT) для получения полноразмерных транскриптов.
- Оценка NMD: инкубация с ингибитором NMD (например, циклохексимид/ингибиторы UPF1) и сравнение уровней транскриптов — чтобы отличить деградацию мРНК от производства стабильных укороченных белков.
- Минигеновые сплайс‑ассays: конструкция с вкраплёнными релевантными интронно‑экзонными участками (включая фланкирующие интроны) для тестирования сплайсинга в контролируемой системе и оценки эффектов предложенных терапий (ASO, малые молекулы).
- Белковый уровень: вестерн‑блот с анти‑тельцами к разным участкам белка (чтобы отличать изоформы), масс‑спектрометрия для определения присутствующих пептидов/концев; иммунолокация (IF) и субклеточная фракцияция.
- Функциональные тесты: специфичные для белка — каталитическая активность, связывание лигандов, транспорт, сигналинг, жизнеспособность клеток, влияние на морфологию/агрегацию. Rescue‑эксперименты: экспрессия WT‑кДНК или мутации, устойчивой к ASO/siRNA.
- Модели клеток и организма: CRISPR‑Knock‑in в подходящую клеточную линию; индуцированные стволовые клетки пациента (iPSC) с дифференцировкой в релевантный тип ткани; животные модели — мыши‑knock‑in или модель с humanized локусом, зебрафиш/дрозофила для быстрых фенотипических скринингов.
- Эксперименты по стабилизации/деградации: ингибиторы протеасомы, анализ полужизни белка (pulse‑chase), рибосомный профиль (Ribo‑seq) при необходимости.
Возможные терапевтические стратегии
- Коррекция сплайсинга:
- Сплайс‑шитчинговые олигонуклеотиды (ASO/Steric‑block) для восстановления нормального сплайсинга или преднамеренного пропуска экзона, если пропуск даёт функциональную белковую форму.
- Малые молекулы, модифицирующие сплайсинг (пример общего класса — сплайсоформины), при наличии подходящих целей.
- Генетическая коррекция:
- Ремонт ДНК: CRISPR‑HDR/базовое редактирование/prime‑editing в случае возможности экзон‑специфичной коррекции сплайс‑сайта. Учесть off‑target и доставку.
- Замена гена/ген‑доставка (AAV, LNP‑мРНК) при потерях функции, если размер гена и тканевая таргетность позволяют.
- Аллель‑специфическое снижение экспрессии:
- RNAi или ASO‑направленные на патологическую изоформу (если доминантно‑негативный эффект) либо деградация через промотирование NMD/siRNA.
- Компенсационные подходы:
- Если укороченный белок частично функционален — фармакологические стабилизаторы/шапероны, ингибиторы деградации.
- Стимуляция альтернативного пути/изоформы, которая может компенсировать функцию.
- Лечение PTC‑содержащих изоформ:
- Индуцирование readthrough (аминогликозиды, ataluren‑подобные) при подходящем контексте стоп‑кодона; учитывать риск нецелевого readthrough.
- RNA‑редактирование (ADAR‑направленное) для коррекции сплайс‑диксомутаций на уровне РНК.
- Иммунологические и клинические соображения: мониторинг образование не‑самоподобных эпитопов при терапии, оценка рисков замещения/подавления аллели.
Практический план действий (кратко)
- Подтвердить и количественно охарактеризовать все изоформы на уровне РНК (RT‑PCR, long‑read RNA‑seq).
- Проверить NMD и белковое выражение (ингибирование NMD, вестерн, MS).
- Использовать миниген и клеточные модели для скрининга ASO и коррекции сплайсинга.
- Перейти к модели организма и/или iPSC‑дифференцированию для оценки фенотипа и безопасности терапий.
- Параллельно рассмотреть генетическую коррекцию, если клинически оправдано.
Если нужно, могу предложить конкретную панель праймеров/дизайн минигена или критерии для выбора ASO/редакторов для вашей конкретной мутации — пришлите последовательность вокруг сплайс‑сайта и желаемые ограничения по доставке.