План экспериментального исследования для выявления и количественного определения антибиотикорезистентных бактерий в пробе почвы. Кратко, структурировано, с указанием методов и контролей.
1) Отбор проб и подготовка
- Отбор: составить композит из $3\text{–}5$ подконтрольных субпроб по участку; хранить при $4^{\circ }\mathrm{C}$, анализ в течение $48$ ч.
- Подготовка суспензии: взвесить $1\mathrm{g}$ почвы, добавить $9\mathrm{mL}$ PBS (фосфатный буфер) → первичная суспензия $10^{-1}$. Сделать серию десятиразовых разведения до $10^{-6}$.
2) Культивирование и количественное определение резистентных бактерий
- Общее количество культивируемых бактерий: посев на ненаправленные среды (например, PCA, R2A) методом нанесения $100\mu \mathrm{L}$ разведений; инкубация при $28\text{–}30^{\circ }\mathrm{C}$ $48\text{–}72$ ч. Расчёт: $CFU/g=\frac{N\times DF}{V}$, где $N$ — число колоний, $DF$ — фактор разведения, $V$ (в граммах эквивалента) — объём посева (для $100\mu \mathrm{L}$ $V=0.1\mathrm{mL}$ и исходная масса $1\mathrm{g}$).
- Количество резистентов к конкретному антибиотику: параллельные пластины с антибиотиком. Использовать:
- серию концентраций: $0.5\times ,1\times ,4\times$ условного клинического брейкпоинта/МПК для целевой таксономии, чтобы оценить частично и высокорезистентные популяции;
- или фиксированные селективные концентрации (энвиринментальные исследования часто используют повышенную селекцию).
- Энри́чмент при низкой частоте: инкубировать суспензию в бульоне с низкой концентрацией антибиотика (энрихмент) и затем посев на селективные среды.
- Реплики: минимум технически $n=3$ для посевов каждого разведения/условия.
3) Выделение и фенотипическая характеристика изолятов
- Выделить отдельные колонии с селективных и неселективных сред; сохранить в глицероле при $-80^{\circ }\mathrm{C}$.
- Проверка чувствительности: стандартный тест MIC методом бульонного микродилюционного теста или дисковый тест (по CLSI/EUCAST) для панели антибиотиков. MIC-запись в формате (например) $\mathrm{MIC}=x\mu \mathrm{g}/\mathrm{mL}$.
4) Молекулярная идентификация
- Первичная идентификация: секвенирование фрагмента 16S rRNA (амплификация и Sanger) или MALDI-TOF.
- Подробно: WGS (короткие риды Illumina для точности; при возможности дополнить длинными ридами Nanopore/SMRT для разрешения плазмид) для каждого интересующего изолята.
5) Детекция и количественная оценка генов резистентности (резистом)
- qPCR/RT-qPCR: таргетные праймеры для наиболее важных ARG (например, bla, tet, sul, qnr, van, mec и т. п.). Абсолютная количественная оценка с калибровочной кривой (плазмидные/геномные стандарты).
- ddPCR для более точной абсолютной квант. оценки при низких копиях.
- Метагеномика (shotgun): получение профиля резистома сообщества; нормировка к числу 16S и объёму библиотек; оценка относительной и абсолютной абундантности ARG.
6) Подходы для различения плазмидной и хромосомной природы резистентности
- Плазмидная экстракция: мини/макси-препараты плазмид из изолятов; профиль по агарозному гелю для размеров.
- Конъюгация/мобилизованность:
- Конъюгационный тест (filter mating) с чувствительным рецептором (например, E. coli маркерный штамм, устойчивый к контраселекции). Соотношение донор:рецептор $1:1$ или $1:10$. Отбор трансконъюгантов на средах с комбинацией антибиотиков (антибиотик резистентности + контраселективный маркер рецептора). Наличие трансфера → плазмидная/мобильная локализация.
- Трансформация/репликация: трансформация плазмидной ДНК в чувствительный штамм (при возможности).
- Плазмидное типирование: PBRT (PCR-based replicon typing) и MOB-typing для определения репликонов и классификации плазмид.
- S1-PFGE + Southern blot: обработка геномной ДНК S1-нуклеазой для линеаризации плазмид, PFGE для разделения крупных плазмид; гибридизация зондами для целевого ARG — позволяет локализовать ген на плазмиде определённого размера.
- Геномный анализ и биоинформатика:
- Сбор WGS (Illumina + Nanopore), гибридная сборка; определение локализации ARG на контигах плазмидного или хромосомного происхождения.
- Инструменты: PlasmidFinder, MOB-suite, mlplasmids, Abricate для выявления ARG; при бинации и аннотировании — проверить контекст (IS, транспозазы, интегоны).
- Плесень Hi-C или plasmidome/long-read метагеномика: в метагеномных образцах Hi-C связывает мобильные элементы с хозяевами, давая прямые связи между ARG, плазмидами и таксонами сообщества.
7) Контрольные эксперименты и валидация
- Положительные/отрицательные контроли: штаммы с известными ARG и плазмидами; чувствительные штаммы.
- Кривые деградации/стабильности плазмид (curing): попытки "излечения" плазмид (температура, химические агенты) и сравнение фенотипа до/после; подтверждение потери гена идентификацией/плазмидной экстракцией. (Учесть возможные побочные эффекты и ограничения метода.)
8) Анализ данных и количественное представление
- Для култивируемых: доля резистентов = $\frac{\mathrm{CFU}\mathrm{на}\mathrm{селективной}\mathrm{среде}}{\mathrm{CFU}\mathrm{на}\mathrm{ненаправленной}\mathrm{среде}}$.
- Для qPCR/ddPCR: копии гена на грамм почвы; нормировка на копии 16S: $\frac{\text{копий ARG}}{\text{копий 16S}}$.
- Статистика: минимум $n=3$ независимых биологических повторов; рассчитывать среднее, SD/CI; тесты на значимость (ANOVA, t-тест, непараметрические при необходимости).
9) Ограничения и замечания
- Культивирование охватывает только культивируемую часть микробиоты. Метагеномика и qPCR дополняют картину.
- Наличие гена не всегда означает фенотипную резистентность (экспрессия, контекст). Напротив, фенотипная резистентность без известного ARG требует поиска мутаций (WGS, сравнение с референсом для выявления SNP в целевых генах).
- Для определения хромосомных мутаций: анализ целевых генов (например, gyrA, parC, rpoB и др.) на наличие известных мутаций в WGS; подтверждение ассоциации фенотипа — рекомбинантная экспрессия/альтернативные тесты.
10) Ресурсы и оборудование (кратко)
- Лаборатория BSL-2 для работы с потенциально патогенными изолятами; оборудование для культивирования, qPCR/ddPCR, секвенирования (или контрактация), PFGE, плазмидные препараты.
Итого: последовательность — от отбора образцов → суспензии и серийных разведений → количественные посевы на селективных и неселективных средах → выделение штаммов → фенотипическая оценка (MIC) → молекулярная детекция ARG (qPCR, WGS, метагеномика) → эксперименты по локализации (конъюгация, плазмидная экстракция, S1-PFGE, гибридная сборка) для различения плазмидной и хромосомной природы резистентности.