Кратко — что проверить и какие эксперименты предложить.
Быстрая проверка (сразу):
- датчики: калибровка pH, $DO$, температуры; проверьте показания против внешних измерений.
- процессы: подтверждение заданных параметров в контроллере (темп., $pH$, скорость аэрации/перекачки).
- видимая инфекция/контаминация: микроскопия, посев на селективные/не селективные среды, 16S PCR/NGS при необходимости.
- инокулюм: здоровье, возраст/объем посева, жизнеспособность (пятна Live/Dead, CFU).
- расходники: новая партия среды/сырья (трикальций, пептон, солевая смесь) — сравнить с прошлой.
- механика: целостность и обструкция распылителя/спаргера, состояние мешалки, утечки, пенообразование/анти-пена.
Биологические факторы и как их проверить:
- потеря продуктивности клеток/вырождение: сравнить продуктивность свежего инокулюма и текущего; проверить генетическую стабильность (PCR на ген/плазмиду, qPCR копий плазмиды, секвенирование).
- плазмидная нестабильность/отсутствие селекции: qPCR на копии, восстановить селективное давление (если применимо).
- мутации/адаптация: resequencing целевых генов или популяции.
- фаги: plaque assay, TEM, специфичные PCR.
- метаболические проблемы: накопление ингибиторов (ацетат, молочная кислота, метаболиты) — HPLC/GC анализ супернатанта; изменение профиля метаболитов (метаболомика).
- снижение жизнеспособности: потоковая цитометрия, CFU vs OD, выявление персистентных или «спящих» клеток.
- индукция стресс-ответа: анализ экспрессии стресс-генов (RT-qPCR, transcriptomics).
- образование биопленки/прилипания: визуальный осмотр, анализ стенок реактора.
Технологические/инженерные факторы и как их проверить:
- перенос кислорода: измерить $k_{L}a$ (динамический метод) и сравнить с эталоном; проверить скорость аэрации и расход газа.
- поддержание $DO$: кривые $DO$ в цикле — наблюдать перепады; если $DO$ упал, увеличить аэрацию/смешивание или использовать кислород.
- мешалка/смешивание: профиль скоростей, гидродинамика, местные концентрации субстрата; проверить гомогенность.
- изменение вязкости/пенообразования: измерить вязкость, визуально оценить пенообразование и эффективность анти-пены.
- проблемы с подачей среды/фидом: точность насосов, блоки питания, засоры.
- очистка/стерилизация: остатки био-материала в трубах/спаргере, проверка автоклавирования/стерилизации на месте (SIP).
- отложение/засоры: осмотр фильтров, спаргера, труб.
Какие измерения/метрики отслеживать регулярно:
- биомасса $X$ (OD, сухая масса), продукция $P$ (титр), субстрат $S$, специфическая скорость продукции $q_P$, удельный рост $\mu$, выход $Y_{P/X}$ или $Y_{X/S}$. Все сравнить с историческими контрольными траекториями.
Экспериментальные изменения/контролируемые тесты (приоритеты):
1) воспроизвести проблему в маленьком масштабе:
- параллельные мини-реакторы/флаконы: текущая культура vs эталонный запас (старый рабочий клён) при тех же условиях — если эталон выдаёт ожидаемое, проблема биологическая.
2) заменить инокулюм:
- использовать свежий ранний лог‑культуру из сохранённого банка; если продукция восстанавливается — проблема инокулюма/степени устойчивости.
3) проверка селективного давления/плазмидной стабильности:
- культура с и без селекции; измерить копии плазмиды и активность продукта.
4) восстановление инженерных параметров:
- увеличить аэрацию/скорость мешалки по шагам, контролируя $DO$ и ломкость клеток; измерить $k_{L}a$ до и после.
5) варьировать подачу субстрата/режим питания:
- сменить batch → fed‑batch с более медленным фидом, чтобы избежать субстратного ингибиции и накопления побочных метаболитов; провести небольшой DOE по скорости фида и исходной концентрации субстрата $S$.
6) антистрессовые добавки:
- добавление трасс‑элементов, витаминов, предшественников продукта, буферов, коррекция осмолярности; тесты в мини-реакторах.
7) тест на фаги/контаминацию:
- если положительно — очистка/замена биомассы, строгое восстановление стерильности, возможное смена штамма.
8) восстановление сенсоров/чистка оборудования:
- очистить/промыть/прокалить спаргер, фильтры; протестировать гидравлику и насосы.
Дизайн эксперимента (быстрый DOE):
- фактор‑варианты: температура, $pH$, $DO$ (целевое значение), скорость аэрации/мешалки, скорость фида.
- метрики: максимальный титр $P_{max}$, удельная продуктивность $q_P$, время до достижения $P_{spec}$, выход $Y_{P/X}$.
- начать с 2–3 уровней по каждому важному фактору (fractional factorial или Plackett‑Burman для скрининга).
Короткие восстановительные действия (если нужно срочно):
- проверить и перекалибровать $DO$/pH датчики; при низком $DO$ временно увеличить аэрацию/скорость мешалки или ввести подачу кислорода; заменить/обновить инокулюм; промыть/прочистить спаргер и линии подачи.
Приоритеты расследования: 1) датчики и параметры процесса, 2) инокулюм и генетика, 3) перенос кислорода/мешалка, 4) контаминация/фаги, 5) состав среды и накопление ингибиторов.
Если нужно, могу предложить конкретный план экспериментов на неделю с наборами условий и критериями успеха.