Кратко по шагам (аналитика → статистика → интерпретация/валидация).
1) Предобработка и контроль качества
- QC ридов: FastQC, Trimmomatic; проверить качество сборок: QUAST, CheckM/BUSCO.
- Если метагеномы — сборка и бининговые MAGs (MEGAHIT/MetaSPAdes + MetaBAT/CONCOCT), оценить чистоту/полноту.
2) Геномная сборка/ориентация и аннотация
- Ассемблировать (SPAdes/Unicycler) или выравнивать против референса (BWA).
- Аннотировать гены: Prokka, Bakta; функциональная аннотация: eggNOG-mapper, InterProScan, KEGG/COG.
3) Пангeном и матрица присутствия/отсутствия
- Кластеризация орфологов: Roary, Panaroo, MMseqs2; получить бинарную матрицу gene × isolate и частоты по средам.
4) Филогенетика и структура популяции
- Построить дерево по конкатенированным маркерам/SNP (IQ-TREE, RAxML).
- Удалить/учесть рекомбинацию: Gubbins.
- Оценить популяционную структуру (FastBAPS, PCA по SNP).
5) Ассоциационный анализ генов (присутствие/отсутствие) с солёностью
- Простые тесты: Fisher/χ² для каждой ген/среда; рассчитывать odds ratio: $OR=\frac{a\cdot d}{b\cdot c}$ (где $a$ = число штаммов с геном в солёной среде и т.д.).
- Филогенетически скорректированные методы: pyseer (LMM с kinship/phylogeny), treeWAS, Scoary. Эти контролируют структуру/связность.
- Коррекция множественной проверки: Benjamini–Hochberg (ранжируем $p_i$ и выбираем $p_i\le \frac{i}{m}\alpha$). Целевой уровень FDR, напр. $\alpha =0.05$.
6) SNP/аллельные ассоциации
- Вайпать SNPs (snippy, bcftools), фильтровать; GWAS на уровне SNP (pyseer unitig/SNP mode) с контролем за структурой.
- Анализ популяционных показателей: разница частот $\Delta f=f_{\text{salt}}-f_{\text{control}}$, $F_{ST}$ между популяциями для локусов.
7) Поиск функций, связанных с осморегуляцией
- Было бы логично явно искать известные гены/домены: системы синтеза/транспорта осмопротектантов (ectABC, proABC, bet, tre/ots), Na+/H+ antiporters (NhaA), каналы, ABC-транспортеры, протеиновые хелперы. Использовать HMMER/BLAST по профильным HMM/базам (Pfam, TIGRFAM).
- Сопоставить результаты ассоциации с биологической функцией.
8) Анализ мобильных элементов и горизонтального переноса
- Проверить плазмиды/фаги (PlasmidFinder, PHASTER); гены адаптации на плазмидах указывают на HGT.
9) Доказательства отбора
- dN/dS для кодируещих генов (PAML, HyPhy) — сигнал положительного отбора; локусы с повышенным dN/dS и частотной сдвиг могут быть адаптивными.
- Региональные сигналы селекции/падение разнообразия.
10) Визуализация и отчётность
- Тепловые карты присутствия/отсутствия, дерево с аннотацией среды, Manhattan-подобные графики p-value, табличка значимых генов с OR/CI и FDR. Указывать размер эффекта и частоты.
11) Валидация
- Сопоставить с независимой выборкой; при возможности — экспериментальная валидация (knockout/overexpression, фитнес в лабораторных условиях с разной солёностью).
- Дополнительные доказательства: экспрессия (RNA-seq) при солёности (DESeq2), белковая активность, локализация на плазмидах.
12) Интерпретация результатов — на что обращать внимание
- Положительная ассоциация ≠ причинность; контролируйте популяционную структуру и окружающие факторы среды.
- Высокая частота гена в солёных средах + биологическая релевантность (осморегуляция) + независимая репликация + сигнал отбора = сильный аргумент в пользу адаптации.
- Если ген локализован на мобильном элементе и присутствует в разных филогенетических линиях — вероятен HGT и быстрый перенос адаптации.
- Малые эффекты или единичные SNPы без функциональной интерпретации требуют осторожности.
Рекомендуемые конкретные инструменты (кратко): FastQC/Trimmomatic, SPAdes/Unicycler, Prokka, Roary/Panaroo, IQ-TREE, Gubbins, pyseer/treeWAS, HMMER/InterProScan, snippy/bcftools, DESeq2 (RNA-seq), PlasmidFinder, PHASTER.
Критерии значимости: FDR $q<0.05$ + убедительный размер эффекта (напр. $OR>2$ и CI не пересекает 1).