Кратко — план экспериментов для определения причины накопления «малых неполноценных митохондрий» (petite/rho-подобных фенотипов) и варианты восстановления роста на неперментируемых субстратах.
1) Быстрая фенотипическая проверка
- Спотовый тест: серийные десятикратные разбавления и высев на средах — ферментируемая (глюкоза) и неперметаболиваемая (например, глицерин/этанол). Используйте разбавления $10^{-1},10^{-2},10^{-3},10^{-4}$. Рост на неперметаболиваемой среде определит долю неспособных к дыханию клеток.
- Подведение: если большинство колоний — petites (не растут на глицерине), вероятна проблема с mtDNA или сборкой ОЭФ.
2) Оценка морфологии и mtDNA
- Микроскопия: митохондриально-таргетированный GFP (mtGFP) или окраска MitoTracker для морфологии; DAPI для нуклеоидов митохондрий. Отсутствие DAPI-сигнала в митохондриях указывает на rho0/rho-.
- Количественная оценка mtDNA: qPCR для нескольких митохондриальных генов (например, COX1, ATP6, 21S rRNA) и ядерного контроля — получить отношение $\frac{mtDNA}{nDNA}$.
- Southern или PCR-продукты для проверки целостности и присутствия длинных mtDNA-фрагментов.
3) Оценка частоты petite и цитоплазматического характера
- Подсчёт частоты petites: раздельный посев одиночных колоний и оценка процента petites.
- Цитодукция/скрещивание с rho+ штаммом (kar1 или через выделение митоплазматического содержимого) — если восстановление происходит при передаче митохондрий, дефект локализуется в митохондриях (mtDNA или митохондриальных белках).
4) Проверка белкового импорта и митохондриальной трансляции
- Тест импорта белков: in vitro импорт радиомеченых прекурсоров (или контроль по обработке митохондриальных предшественников) и Western blot для Tom/TIM компонентов (Tom20, Tim23).
- Митохондриальная трансляция: пульс-метки ${}^{35}$S-метионином в присутствии циклоГЕКСИМИДА (ингибитор цитозольной трансляции) — если митотрансляция снижена, видны пропадающие пептиды митохондриального происхождения.
5) Оценка комплексов дыхательной цепи и сборки
- BN-PAGE + in-gel активности комплекса IV (цитохром c оксидаза) и комплекса III; Western для белков комплексов. Низкая сборка укажет на дефект сборки/митотрансляции.
6) Анализ генов и восстановление
- Секвенирование ключевых ядерных генов, участвующих в репликации/транскрипции mtDNA и динамике митохондрий: MIP1 (полимераза mtDNA), MGM1/FZO1/DNM1 (слияние/деление), genes для сборки COX, TAZ1/CRD1 (кардиолипин).
- При выявлении мутантного ядерного гена — комплементация плазмидой с WT-алелем (трансформация) и проверка восстановления роста на неперметаболивающей среде.
7) Восстановление путем передачи mtDNA
- Цитодукция или скрещивание с rho+ штаммом с последующим отбором за восстановленный рост на глицерине — прямой способ восстановить функцию при дефекте mtDNA.
- Альтернативно, спонтанная репопуляция rho+ при смешивании с WT митохондриями.
8) Доп. проверки причины повреждения mtDNA
- ROS-уровень (DHE, H2DCFDA); если повышен, проба антиоксидантов (NAC) и оценка влияния на частоту petites.
- Температурные тесты: оценить при $30^{\circ }C$ и $37^{\circ }C$ на предмет температурно-чувствительных мутантов.
Приоритет выполнения (быстро→детально)
1. Спотовые тесты на глицерин/глюкозу + микроскопия (mtGFP + DAPI).
2. qPCR/ PCR для mtDNA, оценка частоты petites.
3. Цитодукция/скрещивание с rho+ — попытка быстрого восстановления.
4. Импорт/транскрипция/трансляция и BN-PAGE для уточнения механизма.
5. Секвенирование/комплементация выявленных ядерных генов.
Коротко о восстановлении: если причина — потеря/дефект mtDNA → восстановление через цитодукцию/скрещивание с rho+; если причина — ядерный дефект (MIP1, FZO1, т. п.) → комплементация WT-геном (плазмида) или заменяющие мутации; при повышенном ROS — борьба с источником ROS и антиоксиданты как временная мера.