Краткая многоступенчатая экспериментальная стратегия.
1) Модель и общие параметры
- Модели: человеческие изолированные островки или первичные бета‑клетки; вспомогательно клеточные линии EndoC‑βH1 (чел.) и INS‑1E (крыса) для скринингов.
- Репликаты: биологические $n\ge 3$. Статистика: FDR $<0.05$, корректировка множественной гипотезы (Benjamini–Hochberg).
- Состояния стимуляции: низкий глюкозный (контроль) глюкоза $2.8\text{mM}$, высокий глюкозный (стимул) $16.7\text{mM}$; дополнительные стимулы: KCl деполяризация $30-40\text{mM}$, GLP‑1 (экзоглиптин), сульфонилуреи (глибенкламид) для проверки путей.
2) Открытие кандидатов (геномная аннотация при разных состояниях)
- ATAC‑seq / DNase‑seq в условиях низкий/высокий глюкоза (+/− KCl) для выявления дифференциально открытых регуляторных областей. Контроль: неклеточный шеддинг / spike‑in для нормализации.
- ChIP‑seq для активирующих маркеров H3K27ac, H3K4me1 и репрессоров (H3K27me3) при тех же условиях; ChIP‑seq для ключевых TF (PDX1, MAFA, NKX6.1). Контроль: IgG, входной хроматин.
- Hi‑C / promoter capture Hi‑C / HiChIP (H3K27ac/CTCF) для картирования взаимодействий enhancer–promoter в тех же состояниях. Технические репликаты и spike‑in.
3) Приоритизация элементов
- Критерии: дифференциальная открытость/активация при высоком глюкозе, контакт с промотором INS или с генами секреции, совпадение с TF‑мотивами/футпринтингом, консервация, колокализация с GWAS‑сигналами сахарного диабета 2 типа и eQTL/ATAC‑QTL из человеческих островков. Интеграция через регрессионную модель или machine learning.
4) Функциональные скрины (массовые)
- Массовый CRISPRi/CRISPRa tiling screen по приоритетным рег. регионам в EndoC‑βH1 или первичных клетках с dCas9‑KRAB/VP64: пул sgRNA (~$5-20$ sgRNA на элемент). Селектор: изменение экспрессии INS (FACS, INS‑GFP репортер или scRNA‑seq) и/или функциональный фенотип — секреция инсулина (см. ниже). Контрольные sgRNA: ненаправленные (non‑targeting), положительные (sgRNA против PDX1 промотора), отрицательные (целящиеся в пустое место). MOI низкое для единичной интеграции ($\text{MOI}\approx 0.3$). Пул реплик $n\ge 3$.
- MPRA / STARR‑seq: функциональная оценка активности последовательностей (дифференциально в низком/высоком глюкозе). Контроль: известные активаторы, случайные последовательности.
5) Одноклеточные методы для связи рег. элемента и транскрипции
- Perturb‑seq / CRISPRi + scRNA‑seq: связывает каждое perturbation с изменениями транскриптома, включая INS и гены секреции/каналов. Контроля: non‑targeting, положительные контролы.
6) Функциональная валидация ключевых элементов
- Геномные делеции/мутации (CRISPR‑Cas9, флп/Cre или точечные редакторы) для наиболее значимых элементов в человеческих бета‑клетках; оценка: GSIS (glucose‑stimulated insulin secretion) и внутриклеточное содержание INS.
- Репортеры (люцифераза) с WT и мутантными мотивациями TF; тесты при низком/высоком глюкозе.
- 3C/4C/qPCR подтверждение enhancer–promoter контакта в разных состояниях.
- Rescue‑эксперименты: восстановление активности TF или элемента в делеции.
7) Фенотипические измерения (функция секреции)
- GSIS: инкубация при глюкозе $2.8\text{mM}$ (прайм) затем стимулируют $16.7\text{mM}$; измерение инсулина ELISA в сверхнатанте. Контроль: нормализация на ДНК/протеин/количество клеток. Технич. репликаты $\ge 3$.
- Динамическая секреция (перфузия) для кинетики.
- Кальциевая микроскопия (Fluo‑4) и электрофизиология (patch‑clamp) для проверки влияния на электрическую активность/кальциевые потоки. Контроль: KCl деполяризация.
8) Биоинформатический анализ
- Дифф. экспрессия (DESeq2/edgeR), дифф. доступность, интеграция multi‑omics (e.g., Cicero, ARCHR), мотивный анализ (HOMER), колькация с GWAS/eQTL (coloc, LocusCompare). Значимость: FDR $<0.05$.
9) Контрольные условия на всех этапах
- Биологические и технические репликаты ($n\ge 3$).
- Позитивные контрольные таргеты (PDX1/MAFA/GLUT2), негативные (non‑targeting, housekeeping loci).
- Состояния глюкозы и немодулирующие стимулы для проверки специфичности.
- Нормализация по spike‑in/входному материалу, проверка качества (FRiP для ChIP/ATAC).
- Валидация в человеческих изолятах, а также кросс‑валидация в клеточных линиях.
Коротко: комбинируйте картирование регуляторных областей (ATAC/ChIP/Hi‑C) в разных метаболических состояниях, приоритизируйте кандидаты по контактам и GWAS/eQTL, выполняйте массовые функциональные скрины (CRISPRi/MPRA), связывайте perturbation с транскриптомом через perturb‑seq и подтверждайте критические элементы геномными делециями и функциональными тестами (GSIS, кальций, электрофизиология).