Коротко и по делу — план выборок, методы анализа и обязательные последующие эксперименты.
1) Проба́ми и дизайн выборок
- Рыбы: поражённые и внешне здоровые; ткани: жабры, печень/почки (внутренние органы), кишечник (включая содержимое), кожа/слизь, кровь. Репликаты: по возможности $n=5$–$n=10$ на группу.
- Вода: поверхностная и придонная пробы, объём $1\text{–}5$ L на пробу; фильтрация на фракции $>0.22\mu m$ (бактерии/эвкариоты), $0.02\mu m$ (вирусы), фильтрат (растворённые токсины).
- Осадок и биоплёнки: придонный ил, береговые биоплёнки.
- Планктон/бентос/моллюски/личинки: концентрировать сеткой/фильтрами.
- Контроли: отрицательные (экстракция), лабораторные мок‑сообщества, здравые пруды поблизости.
- Мета‑данные: температура, $pH$, $DO$ (растворённый кислород), электропроводность, аммиак/NH${}_3$, нитрит/нитрат, фосфат, BOD, металлы, пестициды, хлорофилл a; измерять при заборе и повторно через $24$–$48$ ч.
2) Лабораторные методы (мокрая лаборатория)
- Нуклеиновые кислоты: извлечь ДНК и РНК отдельно, сохранять при $-80^{\circ }C$. Для РНК — рибонуклеазная защита и р‑деплетияция.
- Ампликон‑секвенирование: 16S (бактерии/археи), 18S/итс (эвкариоты, простейшие), ITS (грибы). Полезно для профилей и дешёвой разведки.
- Шотган‑метагеномика (крупная ставка): для обнаружения бактериальных/эукариотических генов, сборок и бинов. Рекомендуемая глубина: $>10^7$ прочтений/образец для хорошие диагностики сложных проб.
- Метавирусомика: концентрировать вирусные частицы, фильтрация $0.02\mu m$, нуклеаза (удаление свободной ДНК/РНК), экстракция нуклеиновых кислот, случайная амплификация при необходимости.
- Метатранскриптомика: тотальная РНК (rRNA‑деплетия) для выявления активной инфекции/токсичных метаболических путей.
- Короткие экспресс‑тесты: qPCR/RT‑qPCR для известных патогенов (Vibrio, Aeromonas, Flavobacterium, Saprolegnia, Ichthyophthirius), и для токсин‑генов (например, мcy для микрокистинов, sxt для сакситоксинов).
- Химия/токсикология: ELISA/LC‑MS/MS для цианотоксинов, микотоксинов и пестицидов; измерение нитратов/аммония/тяжёлых металлов.
3) Биоинформатика и анализ данных
- QC: trimmomatic/fastp, удалить контаминанты и хост‑последовательности (маппинг на геном соответствующего вида рыбы; aligner BWA/Minimap2).
- Таксономия: Kraken2/Bracken, Kaiju, MetaPhlAn; объединять для надёжности.
- Сборка и бининг: MEGAHIT/metaSPAdes → binning (MetaBAT2/MaxBin2) → оценка качества CheckM.
- Вирусы: VirSorter, VirFinder, VIBRANT; поиск интегрированных/литических вирусов.
- Функционал: аннотация генов (eggNOG, KEGG), поиск токсин‑клстеров (antiSMASH, BLAST по known toxin genes), ARG (ResFinder, CARD).
- Дифференциальный анализ: DESeq2/ANCOM для обнаружения организмов/генов, ассоциированных с гибелью. Статистика с учётом метаданных (температура, $DO$, химия).
- Сеть/картирование: корреляции микроорганизмов и химпараметров; визуализация кластеров/патогенов.
4) Целевые проверочные эксперименты
- qPCR/RT‑qPCR: разработать/использовать таргетные праймеры для кандидатов и проверить распространённость/титр в большем числе образцов и временных точках.
- Локализация: гистопатология + FISH/иммуноокраска/RNAscope для подтверждения наличия/локализации патогена в тканях.
- Культура и характеристика: попытки выделения бактерий/грибов/простейших; антибиограмма, морфология, патогенности in vitro (клеточные линии).
- Искусственные экспозиционные тесты (модифицированные постулаты Коха): инокуляция здоровых рыб кандидатом(ами) в контролируемых условиях; включить группы: живой изолят, убитый изолят, фильтрат (без клеток), фильтрат $<0.02\mu m$ (вероятный вирус/токсин). Оценить клинические признаки и повторное выделение. Репликаты $n\ge 3$ на группу и контроль. Этические и биоэтич. требования.
- Фракционирование прудовой воды: фильтрация/ультрафильтрация для разделения влияния вирусов/бактерий/растворимых токсинов; тестирование токсичности фракций на моделях (рыбы или клеточные линии).
- Тесты на выживаемость при изменённой среде: контролируемое снижение $DO$, повышение температуры или аммония для проверки, не является ли причина экологической (стресс‑сценарии).
- Токсин‑анализ: LC‑MS/MS по мишеням, подтверждение присутствия и концентраций; сравнить с известными токсичными порогами.
5) Приоритеты и логистика
- Срочно: сразу собрать свежие пробы больных/здоровых рыб, воду и химпараметры. Заморозить/фиксировать и наладить контроль контаминации.
- Параллельно: быстрые qPCR на известные агенты и измерение DO/температуры; если обнаружена высокая концентрация токсинов или классических патогенов — начать лечебные/ограничительные меры.
- Дальше: shotgun + метатранскриптомика и целевые проверки (культивация, инокуляции, FISH, LC‑MS/MS).
Коротко: сочетайте комплексный набор проб (ткани, вода, осадок, планктон) + шотган/метавирусомика + метатранскриптомика + химические и токсикологические тесты, затем таргетные qPCR, локализацию (FISH/гистология), культивацию и контролируемые инокуляционные и фракционные эксперименты для доказательства причинно‑следственной связи.