Краткий план экспериментальной верификации механизма: набор быстрых проверок, далее таргетированные тесты и валидация.
1) Быстрая проверка жизнеспособности и типа снижения пролиферации — зачем: отличить цитотоксичность/апоптоз от клеточного цикла/дифференцировки/старения.
- Жизнеспособность: MTT/AlamarBlue или Trypan blue и подсчет живых/мертвых в временной серии (например, $0$, $6$, $24$, $48$, $72$ ч).
- Апоптоз: Annexin V/PI флоуцитометрия и активность каспаз $3/7$; положительный контроль — стауроспорин.
- Интерпретация: рост Annexin V и каспаз → апоптоз; снижение активности метаболических тестов без апоптоза → клеточный цикл/дифференцировка.
2) Клеточный цикл и проллиферация — зачем: выявить блок на конкретной фазе.
- EdU/BrdU-инкорпорация и PI-стайнинг ДНК + флоуцитометрия → доли в G0/G1/S/G2/M.
- Ki‑67 иммуногистохимия и CFSE/CellTrace для измерения числа делений.
- Интерпретация: накопление в G1 → G1‑арест (проверить p21/p27); уменьшение S‑фракции → блок репликации.
3) Дифференцировка vs сенесценция — зачем: понять, индуктор вызывает зреление или необратимый арест.
- Маркеры дифференцировки (линия‑специфичные): qPCR/вестерн для ключевых маркеров (например, нейрональные/эпителиальные маркеры) и морфология/иммуностайнинг.
- Сенесценция: SA‑β‑gal окраска, p16/p21 экспрессия, SASP (IL‑6, IL‑8) измерение (ELISA/qPCR).
- Интерпретация: повышение дифференцировочных маркеров при снижении пролиферации → дифференцировка; позитивная SA‑β‑gal и SASP → сенесценция.
4) ДНК‑повреждение и стрессовые пути — зачем: исключить генотоксичность или окислительный стресс.
- γH2AX фокусы/комет‑тест для ДНК‑переломов.
- ROS: DCFDA/CellROX; митохондриальная потенциализация: JC‑1; метаболика: Seahorse (OCR/ECAR).
- Интерпретация: высокий γH2AX/ROS → ДНК‑повреждение/оксидативный стресс как причина ареста.
5) Сигнальные каскады и клеточный «контекст» — зачем: найти прямую молекулярную мишень.
- Вестерн/фосфопротеиновый анализ: p53, p21, p27, циклины (D/E/A/B), CDK2/4/6, pERK, pAKT, pSTATs, mTOR, AMPK, Notch/β‑catenin и т.д.
- Протеомные/фосфопротеомные панели или целевые массивы фосфорилирования.
- Интерпретация: изменение уровня/фосфорилирования укажет на задействованный путь.
6) Транскриптомика / омics — зачем: непредвзято выявить пути.
- RNA‑seq (bulk или single‑cell) для анализа дифференциально экспрессируемых генов и GSEA; при необходимости протеомика/метаболомика.
- Интерпретация: обогащённые пути укажут на механизмы (эндоплазматический стресс, иммунный ответ, дифференцировочные программы и т.п.).
7) Автофагия и протеостаз — зачем: автографический ответ может тормозить пролиферацию.
- LC3‑II/p62 вестерн, mCherry‑GFP‑LC3 флюоресцентный анализ; ингибиторы (bafilomycin) для оценки потока.
- Интерпретация: повышение автфагии → возможная адаптивная реакция или путь к гибели.
8) Доза, кинетика, обратимость — зачем: понять зависимость эффекта и его стабильность.
- Кривые доза‑ответ в широком диапазоне (например $[0.01\text{–}10]\mu \mathrm{M}$) и вычисление $I{C}_{50}$/$E{C}_{50}$.
- Временной ряд и washout‑эксперименты: добавить/смыть индуктор и смотреть восстановление пролиферации.
- Интерпретация: обратимый эффект → временная дифференцировка/арест; необратимый → сенесценция или гибель.
9) Генетическая и фармакологическая валидация — зачем: доказать причинно‑следственную связь.
- Использовать ингибиторы/активаторы предполагаемых путей или siRNA/CRISPR‑knockdown целевых белков; посмотреть «rescue» фенотипа.
- Добавление антиоксидантов, факторов роста или экспрессия конститутивно‑активных форм путей для проверки механизма.
10) Технические и артефактные проверки — зачем: исключить посторонние причины.
- Контроль растворителя (DMSO), проверка чистоты/эндотоксинов препарата, pH и осмолярности среды, микробная контаминация, тест на LAL.
- Проверка в другой клеточной линии и в первичных клетках; 3D/ко‑культура для подтверждения релевантности.
11) Дизайн и статистика — коротко:
- Повторности: минимум $n\ge 3$ биологических реплик; технические дубли; предопределённый статистический план.
Рекомендуемая последовательность: быстрые viability/apoptosis + cell‑cycle (первый день), затем маркеры дифференцировки/сенесценции и сигнальные вестерны (день $2\text{–}4$), параллельно dose/time и RNA‑seq для гипотезы, далее генетическая/фармакологическая валидация.