Кратко — какие клеточные стрессы и технологические факторы могут снизить выход рекомбинантного белка и как системно их диагностировать.
1) Проблемы с вилностью/ростом клеток
- Механизм: гибель/апоптоз/отмирание → меньше продуктивных клеток.
- Диагностика: ростовые кривые и Viable cell density (VCD) ($cells/mL$), ${\mathrm{OD}}_{600}$, жизнеспособность (трипан синий, flow cytometry), лактатдегидрогеназа (LDH) в супернатанте (лизис).
2) Потеря плазмиды или снижение копийности/экспрессии конструкта
- Механизм: без селекции клетка теряет плазмиду → нет экспрессии.
- Диагностика: plasmid copy number qPCR ($copies/cell$), селекционный маркер (рост на средах с/без антибиотика), RT-qPCR для mRNA продукта.
3) Транскрипция/трансляция и стабильность мРНК
- Механизм: снижение транскрипции, деградация mRNA, промоторная десактивация.
- Диагностика: RT-qPCR уровней mRNA, Northern blot, промоторные репортеры (GFP/luciferase).
4) Ошибки фолдинга, ER‑стресс и UPR (в eukaryotes)
- Механизм: накопление недофолдингов → UPR/ERAD → снижение секреции/деградация.
- Диагностика: маркеры UPR (BiP/GRP78, CHOP, spliced XBP1) — qPCR/Western; увеличение агрегатов (SDS‑PAGE неразведённый/отделение агрегатов), электрофорез под неосновной/редуцирующей средой; контроль секреции (проба супернатанта).
5) Протеолиз и активность протеаз
- Механизм: деградация белка в периплазме/культуральной среде.
- Диагностика: Western blot для продукта (фрагменты), масс‑спектрометрия для картирования места разреза; измерение протеазной активности (флуорогенные субстраты), добавление ингибиторов протеаз тестово.
6) Накопление включений/агрегатов (inclusion bodies)
- Механизм: белок агрегирует, теряет активность/экспорт.
- Диагностика: световая/электронная микроскопия, анализ растворимой/нерастворимой фракций (центрифугирование + SDS‑PAGE).
7) Окислительный стресс и редокс‑дисбаланс
- Механизм: ROS повреждают белки/DNA → снижение экспрессии и активность.
- Диагностика: ROS индикаторы (DCFDA), GSH/GSSG соотношение, активность антиоксидантных ферментов.
8) Метаболические отклонения — недостаток питательных веществ или накопление токсинов
- Механизм: дефицит глюкозы/аминокислот, накопление лактата/аммиака → подавление синтеза белка.
- Диагностика: анализ среды (глюкоза, лактат, аммиак, кетоновые тела), ATP уровень, профиль метаболитов (LC/MS), off‑gas (CO2, O2) и расчёт OUR/CER; расчёт $RQ=\frac{CER}{OUR}$.
9) Кислородное ограничение и низкий $k_{L}a$
- Механизм: гипоксия ограничивает рост и синтез.
- Диагностика: DO лог (уделяйте внимание значениям DO, например DO $<20\%$ сатурации), off‑gas, измерение $k_{L}a$, повышение аэрации/мешалки тестово.
10) Неправильная температура / pH / осмолярность / осмотический стресс
- Механизм: чувствительность белка/клеток к температуре/pH.
- Диагностика: журналы температуры и pH, целевые тесты при разных температурах/значениях pH, измерение осмолярности.
11) Механические/сдвиговые повреждения (сильный аэрирование, насосы)
- Механизм: повреждение клеточных оболочек и секреции.
- Диагностика: визуализация клетки (микроскопия), анализ LDH/целостности мембраны, сопоставление режимов перемешивания.
12) Плохая доставка/индукция и неправильный режим кормления (fed‑batch)
- Механизм: неверное время/концентрация индуктора (IPTG, метанол и т.п.) или неправильный профиль подачи субстрата → метаболический бёрден.
- Диагностика: лог индукции, измерение концентрации индуктора в среде, тесты разных режимов индукции, анализ остатков субстрата.
13) Контаминация (бактерии, дрожжи, вредоносные микроорганизмы, вирусы)
- Механизм: конкуренция/токсины/потребление истоков.
- Диагностика: микроскопия, посев на селективные среды, 16S/ITS PCR или NGS для идентификации, быстрый тест микоплазмы/вирусов ( для клеточных культур).
14) Негативные эффекты масштаба (scale‑up) и сенсоры/оборудование
- Механизм: иные гидродинамика/массообмен/меры контроля при увеличении объёма.
- Диагностика: сравнение kLa, DO/pH профилей между масштабами, CFD‑моделирование, проверка калибровки сенсоров.
15) Изменение гликозилирования/посттрансляционных модификаций (для секретируемых eukaryotic белков)
- Механизм: неправильная модификация уменьшает стабильность/активность.
- Диагностика: гликан‑анализ (MS), хроматография по заряду и размерам, биоактивность.
Рекомендуемая диагностическая последовательность (быстро и эффективно):
1) Проверить логи биореактора (темп, pH, DO, аэрация, кормление).
2) Оценить рост и жизнеспособность (${\mathrm{OD}}_{600}$, VCD, viability).
3) Измерить продукт в клетках и в супернатанте (SDS‑PAGE/Western/ELISA/активность).
4) Оценить mRNA (RT‑qPCR) и plasmid copy number (qPCR).
5) Анализ среды (глюкоза, лактат, NH${}_4^{+}$, pH, осмолярность) и off‑gas (O2/CO2).
6) Проверить на контаминацию и протеазы.
7) При признаках ER/фолдингового стресса — UPR‑маркеры и агрегаты; при окислительном стрессе — ROS/GSH.
8) При необходимости — секвенирование конструкции/штамма и тесты на стабильность.
Если нужно, могу составить чек‑лист диагностики с конкретными аналитическими методами и пороговыми значениями для вашей системы (бактерии vs дрожжи vs млекопитающие).