Кратко и по делу — набор экспериментов для оценки роли аутофагии в патогенезе и её терапевтического потенциала.
1) Подтвердить индукцию аутофагии и отличить накопление аутофагосом от блокирования флюкса
- Отметки: измерить $LC3$-I/II (вестерн-блот) и уровень $p62/SQSTM1$.
- Флюкс: сравнить с и без лизосомальных ингибиторов (например, bafilomycin A1); рост $LC3$-II при добавлении ингибитора = активный флюкс, отсутствие роста = блокада.
- Тандемный репортер mCherry-GFP-LC3 — подсчитать желтые (нелизированные) и красные (лизосомальные) везикулы.
- EM и конфокальная микроскопия для визуализации аутофагосом и ко-локализации вирусных белков с аутофагосомами.
2) Оценить причинно-следственную связь генетически
- Потеря функции: siRNA/shRNA или CRISPR knockout генов аутофагии (например, $ATG5$, $ATG7$, $BECN1$).
- Повышение функции: переэкспрессия ключевых белков (например, Beclin1) или активирующие мутации.
- Результат: сравнить вирулентность (титры вируса, копии РНК/DNA), виживаность клеток и маркеры смерти при контроле vs модификации.
- Рескью: восстановление экспрессии гена (rescue) должно вернуть фенотип — важный контроль специфичности.
3) Фармакологическая модуляция (быстрая проверка)
- Ингибиторы аутофагии: 3-MA (инициация), chloroquine/ hydroxychloroquine, bafilomycin A1 (блокада фузии/кислотности).
- Индукторы: rapamycin, Torin1.
- Делать дозозависимые кривые и оценивать $I{C}_{50}$ / $E{C}_{50}$ для подавления/активации вируса и выживаемости клетки; например, тест диапазона концентраций $1\mathrm{nM}$–$10\mu \mathrm{M}$ в зависимости от препарата.
- Комбинации с антивирусными препаратами для синергии.
4) Функциональные конечные точки
- Вирусная репликация: plaque assay, TCID50, qPCR для вирусной нуклеиновой кислоты.
- Клеточная выживаемость: MTT/CellTiter-Glo, Annexin V/PI, измерение каспазной активности.
- Иммунный ответ: уровни цитокинов (ELISA), сигнальные пути (фосфор-белки).
- Временные курсы: измерять на $6\mathrm{h}$, $24\mathrm{h}$, $48\mathrm{h}$ и т.д., чтобы увидеть временную зависимость аутофагии и смерти.
5) Механистические исследования
- Ко-локализация вируса с аутофагосомами/лизосомами (иммунофлуоресценция, EM).
- Определить, используется ли аутофагия для репликации (провирусная) или для деградации вируса (ксенофагия): снижение репликации при ингибировании аутофагии = провирусная роль; увеличение репликации при ингибировании = антивирусная роль.
- Анализ селективной аутофагии (пег/митофагия) — маркеры митохондрий, ubiquitin-партнёры, p62-рецепторы.
- Взаимодействие вирусных белков с аутофагическими компонентами (Co-IP, масс-спектрометрия).
6) In vivo валидация и оценка терапевтического потенциала
- Инфекция подходящей модели животных с и без фармакологической модуляции аутофагии или на фоне тканеспецифического knockout $Atg$-генов.
- Оценить вирусную нагрузку в органах, патоморфологию, выживаемость, воспаление.
- Фармакология: определить терапевтический индекс (эффективная доза vs токсичность), фармакокинетику и безопасность при длительном подавлении аутофагии.
7) Контроли и важные оговорки
- Обязательные контроли: неинфицированные клетки, лишённые/контрольные siRNA, неактивные аналоги препаратов.
- Отличайте накопление из-за блокировки лизосом от истинного увеличения аутофагии (флюкс!).
- Учитывайте системную роль аутофагии — системное ингибирование может быть токсично; оценивать тканеспецифические и временные стратегии.
- Возможность аутофагии-независимых функций ATG-белков — подтвердите специфику резку/фармакологию рескью/мутациями.
Приоритетный план (быстро): 1) подтвердить флюкс (LC3-II + bafilomycin, mCherry-GFP-LC3), 2) краткие фарм-эксперименты на дозах и времени с контролями, 3) genetic KO/siRNA с рескью, 4) in vivo проверка при положительных результатах.
Если нужно, могу предложить конкретную панель препаратов, рецептов концентраций и временных точек для вашей системы клеток и вируса.