Ниже — практическое руководство (критерии, план эксперимента и перечень валидационных/вмешательских мероприятий) для выявления источников антибиотикорезистентности (АР), путей её передачи и проверки вмешательств на основе данных генетического секвенирования микробиоты пациентов в двух клиниках (одна с более высокой частотой АР-инфекций).

Ключевые принципы

Сочетать геномную/метагеномную аналитку с эпидемиологическими метаданными (время, место, контакты, антибиотикотерапия, процедуры, оборудование, вода/канализация, персонал).Различать перенос клоний (тот же штамм) и перенос мобильных генетических элементов (плазмиды, транпосоны) — оба важны, требуют разных критериев доказательства.Использовать гибридный подход секвенирования: глубокая short-read для чувствительности + long-read для разрешения плазмид/мобильных элементов.

1) Гипотезы (пример)

H1: Повышенная частота АР-инфекций связана с циркуляцией одного/нескольких клонов патогенов, распространяющихся между пациентами/оборудованием.H2: ARG распространяются между разным микробным фоном посредством плазмид/транспозонов, независимо от клоничности.H3: Источники включают конкретные объекты (раковины/канализация, медицинские приборы), персонал или антибиотик-давление.

2) Критерии/маркеры, которые будут считать доказательством передачи/источника

Клоническая передача (штамм-штамм):
Картина: изоляты от разных пациентов/объектов имеют высокую схожесть в core-genome (низкое число SNP) или идентичный cgMLST-профиль.Практический критерий: расстояние по SNP или отличия в cgMLST ниже species-специфического порога, подтверждённого литературой/локально (напр., для многих Enterobacterales пороги порядка десятков SNP для недавней передачи; уточнить по виду).Спatio-temporal совпадение: совпадение по времени и месту (напр., те же палаты, те же процедурные).Плазмидно-медиированная передача:
Идентичные/почти идентичные плазмидные последовательности (бэкон, репликон-тип, бэкенд ARG-кассет) найденные в разных видах/штаммах.ARG на одной и той же конкатенированной последовательности/контексте (транспосон+IS).Подтверждённая подвижность в опытах (конъюгация/трансформация).Экологическое/точечное происхождение:
Совпадение тех же клоний/плазмидов в окружающей среде (раковина, слив, вентилятор, оборудование, поверхности), в персонале или в сточных водах.Статистически значимая ассоциация (логистическая регрессия, adjusted OR) между экспозицией и носительством/инфекцией.Аргументы за отсутствие связи:
Высокая генетическая дистанция, отсутствие пространственно-временной корреляции, отсутствие эпидемиологических связей.

3) Дизайн исследования — обзорный план (этапы)
A. Сбор образцов и метаданных

Популяции/точки: пациенты (при поступлении, при выписке, при развитии инфекции), персонал (носительство), оборудование/поверхности, раковины/сливные тракты, вентиляция, растворы/лекарства, сточные воды/канализация.Временная схема:
Фазa 1 (описательная): интенсивная перекрёстная/лонгитюдная выборка 2–3 мес для выявления паттернов.Фазa 2 (тестирование вмешательств): после гипотез и пилотных вмешательств — повторное измерение.Частота/объем:
Пациенты: целевой минимум ~50–100 образцов/клиника для сравнения резистомов (точность зависит от желаемой мощности; сделать power-анализ для конкретных показателей).Окружающая среда: регулярные выборки из ключевых точек (раковины, сливы, ИВЛ, ультразвук, лампы и т. п.).Персонал: периодическое тестирование (назальные, ладонные мазки).Метаданные: пациентский ID, дата/время, отделение, палата, процедуры, вводимые устройства, антибиотики (доза/дата), длительность госпитализации, контакты с другими пациентами, результаты клинических культур, клинический исход.

B. Лабораторные методы

Параллельно:
1) Метагеномное (shotgun) секвенирование образцов микробиоты (стул, нос, кожа, раковины) — для резистома и микробиального состава.
2) Выделение и секвенирование культурных изолятов из клинических культур и целевых посевов окружающей среды — для высокоточного сравнительного анализа (WGS).
3) Long-read (ONT/PacBio) для выбранных изолятов/метагеномных контигов для точной сборки плазмид и идентификации МГЭ.Глубина:
Метагеном: достаточная глубина to detect low-abundance ARGs (зависит от матрицы; часто 5–20 Gbp/образец для фекалий).Изоляты: стандартная глубина для качественной сборки (минимум 50–100×).Качество: включить позитивные/негативные контролли (mock-community, blank extraction).

C. Биоинформатика и аналитика

Предобработка: QC, удаление хоста, нормализация.Для метагеномов:
Определение ARG (CARD, ResFinder, AMRFinder), нормализация по 16S/кБ или TPM; сравнение относительного бремени ARG (resistome profile).Профилирование микробиоты (MetaPhlAn, Kraken2).Сборка и бининг (MEGAHIT/MetaSPAdes + binning: Metabat/CONCOCT) для получения MAG.Детекция плазмидных контигов (PlasFlow, MOB-suite), поиск мобиломов (ISfinder, TnCentral).Для изолятов:
SNP-анализ/core-genome (Snippy, Parsnp, Roary + IQ-TREE), cgMLST.Плазмидный анализ (MOB-suite), полная аннотация ARG и МГЭ.Трассировка передачи:
Фильтр по низкому числу SNP + одинаковому плазмиду + эпидемиологической связи → сильное доказательство передачи.Строить временные филогенетические деревья и использовать Bayesian/phylogenetic transmission models (TransPhylo, BactDating) при необходимости.Статистика:
Сравнение клиник: PERMANOVA/Adonis для профильных различий; GLM/логистическая регрессия для факторов риска (adjusted).Source tracker (SourceTracker2) для атрибуции источников метагеномных профилей.Сетевая аналитика контактов + генетическая дистанция для построения путей передачи.

D. Валидационные эксперименты (в лаборатории)

Конъюгация/фильтр-мейтинга: проверка передачи подозреваемых плазмид в моделях in vitro (донор/реципиент).Клонирование/проверка выражения ARG (если необходимо).Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) для корреляции генотип-фенотип.Плазмидное «cure» и проверка потери резистентности.Функциональные метагеномные библиотеки (по желанию) для обнаружения новых/неизвестных ARG.

4) Критерии мощной доказательной связи источника/пути передачи

Уровень доказательности для «источник — передача»:
Высокая: совпадение клинических изолятов и образца источника в core-genome (SNP ниже species-специфического порога) + идентичные плазмидные последовательности (бэкграунд и контекст ARG) + эпидемиологическая корреляция (время/место).Средняя: совпадение плазмидов/ARG-контекстов в разных видах без клонической идентичности, с временной/пространственной связью.Низкая: только похожие ARG в резистомах без генетического контекста или эпидемиологических связей.Дополнение: функциональная демонстрация передачи (конъюгация) повышает вес доказательства.

5) Вмешательства (на уровне гипотезы и практики) и план оценки эффективности

Инфекционный контроль:
Усилить гигиену рук, обучение персонала, соблюдение барьерных мер.Координированное дезинфицирование высокорисковых зон (раковины, сливные тракты) с проверкой эффективности (до/после секвенирования).Механические изменения (переоснащение/проектирование раковин/сливов), если они доказаны источниками.Стратегии по воде/канализации:
Частая очистка сифонов, применение систем обратной промывки/ультрафиолета, барьеры между сливом и рабочей зоной.Антибиотик-стewardship:
Снижение ненужной антибиотикотерапии, ежедневный ревью, оптимизация дозировок, сокращение длительности — измерять влияние на resistome.Контроль плазмидов/переноса:
Ограничение совместного использования оборудования, выделение пациентов/кохортирование при вспышках, деколонизация (только при доказанной пользе и безопасности).Оценка вмешательств:
До/после дизайн с повторным секвенированием и измерением: частота АР-инфекций, распространённость носительства, abundance ARG (нормализованный), частота выявления целевых плазмид/штаммов.Временные тренды и статистические тесты (interrupted time series, segmented regression).

6) Метрики успеха / ключевые конечные точки

Клинические: снижение числа АР-инфекций (по 1000 пациенто-дней), снижение колонизации новыми резистентными штаммами.Молекулярные: снижение частоты/нагрузки целевых ARG/plasmid types, исчезновение идентичных штаммов в среде и у пациентов.Процессные: улучшение соблюдения контроля инфекции, уменьшение использования определённых антибиотиков.

7) Размер выборки и мощность (ориентиры)

Для обнаружения отличий в prevalences/abundance resistome: обычно n>50–100 на группу; но точная мощность рассчитывается по ожидаемому эффекту (размер эффекта) и дисперсии. Рекомендуется провести power-анализ для ключевых показателей (prevalence ARG, Shannon diversity, частота клонической передачи).

8) Практические/этические и биобезопасностные соображения

Согласие пациентов/персонала, защита персональных данных.Биобезопасность при работе с патогенами высокого риска.Лабораторная ответственность при манипуляции с мобильными элементами (ограничить распространение).

9) Ограничения и риски

Метагеном не всегда разрешает полную реконструкцию плазмидов; long-read необходим.Пороговые значения SNP являются specie- и контекст-зависимыми — использовать литературу и локальные контрольные штаммы.Корреляция ≠ причинность: требуются валидационные эксперименты и эпидемиологические доказательства.

10) Итоговый пошаговый рабочий план (сроки ~6–12 мес для начальной фазы)

Сбор требований, согласий, выбор точек и разработка SOP (0.5–1 мес).Начальная интенcивная фаза сбора образцов и метаданных (2–3 мес).Лабораторный анализ: культивирование, митагеном, WGS, long-read для ключевых образцов (параллельно, 2–4 мес).Биоинформатический анализ, выявление гипотез о источниках/пути передачи (1–2 мес).Валидационные эксперименты (конъюгация, MIC и т.п.) и целевые дополнительные пробы (1–2 мес).Проект вмешательств на основе результатов, внедрение пилота и мониторинг (3–6 мес).Повторный анализ и оценка эффективности (после 3–6 мес).

Если хотите, могу:

Составить конкретный список образцов/точек отбора и форму метаданных.Помочь подобрать bioinformatic pipeline (команды и инструменты) и параметры QC.Рассчитать ориентировочный размер выборки при заданных ожидаемых эффектах (предоставьте ожидаемые средние/дисперсии или желаемую минимальную разницу для обнаружения).

Готов продолжить и подготовить детализованный протокол/чек-лист для вашей команды — скажите, какие у вас есть данные сейчас (количество образцов, тип секвенирования, метаданные).