Краткая цель: проверить, влияет ли состав микробиоты почвы на рост культурных растений (биомасса, урожайность, здоровье). Гипотеза: изменение/введение определённой микробиоты изменяет рост растений по сравнению со стерильной почвой или контрольной микробиоте.
1) Дизайн эксперимента (пошагово)
- Факторы и уровни: минимум 3 уровня (пример): (A) стерильная почва (автоклав/гамма-облучение), (B) стерильная почва + инокулят (исходная/целевой микробиом), (C) нестерильная почва (естественная). По необходимости добавить (D) стерильная почва + убитый инокулят (шам-контроль).
- Растения: одна генетически однородная культура (один сорт/партия семян).
- Репликация: предварительно выполнить расчет мощности, ориентир: минимум $n=8\text{–}12$ независимых горшков/растений на уровень; точное $n$ рассчитывается как ниже.
- Рандомизация и блочность: расположение горшков рандомизировать; использовать блоки по месту/шкале (например, полки в теплице) и включать блок как случайный эффект.
- Время и точки отбора: базовый (до инокуляции), затем регулярные замеры (например, еженедельно) и финальная оценка на вегетационном этапе/сборе.
- Обработки почвы: стерилизация (автоклав/гамма), получение инокулята (суспензия из незагрязнённой почвы, фильтрация/концентрация), стандартизированная доза (например, $x$ мл суспензии с заданной клеточной нагрузкой).
- Измеряемые показатели растений: всхожесть, длина побегов, надземная и корневая биомасса (свежая/сухая), урожайность, содержание N/P/K в тканях, индекс здоровья/болезней.
- Микробиологические измерения: образы почвы/корней для 16S rRNA/ITS-секвенирования, qPCR total bacteria/fungi, платинг для численного УВП. Время отбора: до, середина, финал.
- Условия выращивания: одинаковые свет, температура, поливный режим и удобрения для всех горшков.
2) Методы контроля и валидации
- Контроли: стерильный контроль, убитый инокулят, отрицательные контролируемые образцы для секвенирования (бланки).
- Валидация стерильности/инокуляции: посевы/qPCR для проверки отсутствия/наличия микробов до и после.
- Стандартизация инокулята: подсчёт клеток/генов в единице объёма с помощью qPCR/флурометрии.
3) Контролируемые и неконтролируемые переменные
Контролируемые:
- генотип/источник семян;
- состав/объём грунта (до стерилизации);
- метод и степень стерилизации;
- объём и состав инокулята (количество клеток/ДНК);
- температура, свет (интенсивность и длительность), влажность воздуха;
- режим полива и удобрения (тип и доза);
- размер и тип горшка;
- время посадки и сборов;
- измерительные протоколы (веса, длины, аналитические методы).
Неконтролируемые (или частично контролируемые):
- микроразличия в микроклимате (малые градиенты внутри теплицы);
- случайная контаминация (воздушные микробы, насекомые);
- стохастика колонизации микроорганизмов;
- мутации/физиологические различия отдельных растений;
- технический шум в секвенировании (PCR bias, библиотечная ошибка);
- неполное уничтожение микробов при стерилизации в отдельных порциях почвы.
4) Статистическая обработка данных
a) План анализа исходных данных растений:
- первичная проверка: примеры описательных статистик (средние, SD, медианы), визуализация (boxplots, time series).
- проверка нормальности и гомогенности дисперсий: тест Шапиро — Уилк ($p$-уровень), тест Левена.
- если сравниваются более двух групп: однофакторный ANOVA при выполнении допущений; модель:
$$Y_{ij}=\mu +T_i+B_j+{\epsilon }_{ij},$$ где $T_i$ — фиксированный эффект обработки, $B_j$ — случайный эффект блока, ${\epsilon }_{ij}\sim N(0,{\sigma }^2)$.
- при повторных измерениях во времени — линейная смешанная модель:
$$Y_{ijkt}=\mu +T_i+Tim{e}_t+T_i\times Tim{e}_t+(1|Bloc{k}_j)+(1|Plan{t}_k)+{\epsilon }_{ijkt}.$$ - если допущения не выполняются — преобразования (лог, корень) или непараметрические тесты (Kruskal–Wallis) или бутстрэп.
b) Подбор размера выборки (примерная формула для сравнения двух средних):
$$n=\frac{2{\sigma }^2(z_{1-\alpha /2}+z_{1-\beta }{)}^2}{{\Delta }^2},$$ где ${\sigma }^2$ — ожидаемая дисперсия, $\Delta$ — минимально важная разница между средними, $z$ — квантиль нормального распределения для уровня значимости $\alpha$ и мощности $1-\beta$.
c) Пост‑hoc и множественные сравнения:
- после ANOVA — тесты Tukey HSD или Dunnett (когда есть общий контроль).
- скорректировать множественные сравнения: Benjamini–Hochberg или Bonferroni в зависимости от количества тестов.
d) Оценка эффекта и доверительные интервалы:
- эффект размера (Cohen's d, частичная ${\eta }^2$), 95% СИ для разницы средних.
e) Анализ микробиоты:
- препроцессинг: фильтрация, дедупликация, контроль качества, нормализация (DESeq2 size factors или CLR после псевдозамены нулей).
- альфа-диверсность: расчёт Shannon/Simpson/Observed; сравнения с ANOVA/Kruskal‑Wallis.
- бета-диверсность: расстояния Bray–Curtis/UniFrac; визуализация PCoA/NMDS.
- статистика для структурных различий: PERMANOVA (adonis) с учетом блоков:
$$\text{distance}\sim Treatment+Block.$$ - дифференциальная представленность таксонов: DESeq2, ANCOM/ALDEx2; корректировка множественных тестов.
- связывание микробных профилей с растительными признаками: редундантный анализ (RDA), CCA, корреляции (Spearman/Pearson) или случайные леса для предсказания биомассы.
- сетевой анализ и выявление ключевых таксонов (hub taxa) — интерпретировать осторожно.
f) Проверка устойчивости выводов:
- бутстрэп/пермутационные тесты;
- sensitivity analysis: исключение явных выбросов, проверка результатов при разных нормализациях.
5) Возможные источники смещения (bias) и способы минимизации
- контаминация при стерилизации или инокуляции: минимизация через стерильные техники, бланки, проверочные посевы.
- эффект горшка/потковая среда (pot effect): использовать адекватный объём, одинаковые горшки, возможно пробное поле-испытание.
- нерепрезентативность инокулята (источник почвы): использовать реплицированные инокуляты из разных мест или создать синтетическую сообщество.
- PCR и секвенирование: индекс‑перепутывание, batch effects — случайная разбивка образцов по библиотекам, включение mock communities и контрольных образцов.
- неадекватная рандомизация и незамеченные конфаундеры: тщательная рандомизация, блокировка и учёт переменных в моделях.
- selective reporting/publication bias: заранее зарегистрировать протокол (пре-регистрация), четкий план анализа.
- операторский bias при фенотипировании: слепая оценка, автоматизация измерений (взвешивание, снимки + софт).
6) Рекомендации по отчётности
- привести полный протокол стерилизации/инокуляции, состав и концентрацию инокулята, время и условия выращивания;
- включить данные контроля качества секвенирования и отрицательные контроля;
- описать все фильтрации и нормализации данных;
- привести коды статистического анализа и необработанные данные в репозитории.
Краткая итоговая стратегия: рандомизированный контролируемый эксперимент со стерильной и инокулированной почвой, достаточной репликацией (рассчитанной по мощности), блокировкой по месту, последовательным сбором фенотипических и микробиомных данных; анализ через смешанные модели для фенотипов и комплексный био‑статистический анализ микробиоты (альфа/бета‑диверсность, PERMANOVA, дифференциальная представленность), с вниманием к источникам систематической ошибки и с применением корректировок множественных тестов.