Цель: определить, как изменение концентрации CO${}_2$ влияет на скорость роста пресноводных водорослей.
Краткая методика
- Подготовка: выберите культуру одно вида водорослей (монотипная культура), стандартную среду (например, BG‑11) и фотобиореакторы/колбы одинакового объема.
- Лечение (фактор): создайте градацию концентраций CO${}_2$ (газовой подачей или добавкой бикарбоната). Рекомендуемые уровни: $0.04\%$ (атмосферный), $0.4\%$, $1\%$, $2\%$ — по крайней мере по $\ge 3$ репликата на уровень.
- Поддержка: подавайте смеси воздуха/CO${}_2$ через распылитель для равномерного распределения; скорость подачи одинаковая для всех культур.
- Время и частота: длительность эксперимента $7$–$14$ суток; измерения каждые $24$ часа.
Измеряемые параметры и расчёты
- Основной показатель роста: оптическая плотность (OD) при подходящей длине волны (например, $O{D}_{680}$) или количество клеток/мL (подсчёт по счётной камере/флоуцитометр).
- Расчёт удельной скорости роста $\mu$:
$$\mu =\frac{\ln N_2-\ln N_1}{t_2-t_1}$$ где $N$ — OD или число клеток в моменты $t_1,t_2$.
- Время удвоения:
$$T_d=\frac{\ln 2}{\mu }.$$ - Дополнительно измеряйте концентрацию растворённого CO${}_2$/DIC, pH и щёлочность (alkalinity) для интерпретации карбонатной химии.
Контролируемые переменные (жёстко фиксировать)
- Свет: интенсивность (люкс или $\mu$mol photons·m${}^{-2}$·s${}^{-1}$) и фотопериод (например, $12:12$ ч).
- Температура: фиксировать термостатом, например $20$–$25$°C.
- Питательные вещества: одинаковый состав и концентрации в среде (N, P, микроэлементы).
- Начальная инокуляция: одинаковая начальная плотность $N_0$.
- Объём и геометрия сосудов, перемешивание/аэрация (интенсивность мешания).
- Скорость газовой подачи (тот же поток для всех проб).
- Репликация: минимум по $\ge 3$ на уровень CO${}_2$.
Возможные источники ошибок и способы их минимизации
- Изменение pH при повышенном CO${}_2$ (влияет на биохимию): контролировать pH, использовать буфер (например, HEPES) или измерять DIC/щёлочность и учитывать при анализе.
- Нехватка питательных веществ при быстром росте (переход в лимит): обеспечить избыточные питательные запасы или контролировать концентрации N/P в ходе эксперимента.
- Самозатенение/нелинейность OD при высокой плотности: разбавлять пробы перед измерением и аппроксимировать рост только в экспоненциальной фазе.
- Нерегулярное распределение CO${}_2$ в объёме: обеспечить хорошее перемешивание и равномерную аэрацию.
- Контаминация посторонними организмами: работать в асептических условиях, включать контроль без инокулята.
- Ошибки измерений (OD, подсчет клеток): использовать калибровочные кривые OD vs клеточная концентрация / сухая масса.
- Физиологическая адаптация/акклиматизация: дать культурам предакклиматизироваться к каждому уровню CO${}_2$ несколько дней перед началом учёта.
Интерпретация результатов
- Постройте кривые роста (OD или клетки vs время) для каждого уровня CO${}_2$, вычислите $\mu$ в экспоненциальной фазе.
- Сравните $\mu$ между уровнями CO${}_2$ статистически (ANOVA, пост‑hoc тесты). При наличии тренда выполните регрессию $\mu$ vs [CO${}_2$].
- Ожидаемые сценарии:
- Увеличение $\mu$ при повышении CO${}_2$ до насыщения (лацерная зависимость), можно аппроксимировать моделью Михаэлиса–Ментен:
$$\mu ={\mu }_{\max }\frac{[C{O}_2]}{K_{C{O}_2}+[C{O}_2]}.$$ - При очень высоком CO${}_2$/низком pH — подавление роста (кислотный стресс).
- Отсутствие эффекта — рост лимитируется другими факторами (свет, питание).
- Сопоставляйте изменения pH и DIC с изменениями $\mu$ для разделения эффектов прямого углеродного насыщения и косвенных эффектов через кислотность.
Краткий контрольный список перед стартом
- Репликация $\ge 3$.
- Одинаковая инокуляция и среда.
- Измерения: OD, pH, DIC/щёлочность, при возможности хлорофилл‑a.
- План статистического анализа (ANOVA/регрессия).
Эта методика позволяет количественно оценить влияние CO${}_2$ на рост и отличить прямые углеродные эффекты от эффектов, вызванных изменением карбонатной химии.