Коротко: возможные химические механизмы снижения активности дыхательной цепи и набор аналитических методов для проверки каждой гипотезы.

Возможные механизмы

Прямая ингибиция ферментных комплексов:
блокада комплекса I (например, связывание с FMN/Fe–S), II, III или IV (цитохром c оксидаза);Дисфункция АТФ‑синтазы (инhibition или обратная работа);Диссоциация/нарушение суперкомплексов (нарушение передачи электронов);Протонное «размывание» (ункуполирование) — усиленный протонный ток через мембрану (протонный шунт);Окислительное повреждение липидов (кардиолипин) и белков — пероксидизация, 4‑HNE, окисление коферментов (CoQ), модификации цистеинов (S‑нитрозилирование, S‑глутатионилирование);Открытие mPTP (mitochondrial permeability transition pore) → утечка Δψm, выход цитохрома c;Нарушение транспорта субстратов/коферментов (митохондриальный пируватный переносчик, ANT — ADP/ATP транслоказа, CoQ pool);Интоксикация, приводящая к накоплению ROS и редокс‑блокаде (изменение соотношения NADH/NAD+);Повреждение митохондриальной ДНК/синтеза белков ОЭФ → снижение сборки комплексов.

Какие наблюдения соответствуют каждому механизму (кратко)

Ингибиторы комплексa I → упадок NADH‑зависимой (пируват/малат) оксигенации, сохранение сукцинат‑зависимой;Ингибирование комплекса IV → снижение ответа на TMPD/аскорбат, накопление редуцированного цитохрома;Ункуполирование → повышение базальной скорости O2‑потребления, падение АТФ‑синтеза; при добавлении FCCP рост OCR, при добавлении олигомицина снижение;Ингибиция АТФ‑синтазы → высокий Δψm при низком OCR и низкий ATP уровень;mPTP → быстрая потеря Δψm, выход цитохрома c, снижение комплексов в целых митохондриях.

Аналитические подходы и последовательности экспериментов

Функциональная респирометрия

Высокорезолюционная респирометрия (Oroboros) или Seahorse XF в живых клетках:
SUIT‑протоколы (подбор субстратов и ингибиторов) — выявить блокаду на уровне конкретного комплекса;измерить состояния: State 2/3/4, RCR ( \mathrm{RCR} = \frac{\text{State 3}}{\text{State 4}} ), ADP/O ((\frac{\text{ADP добавлено}}{\text{O}_2 \text{ потреблено}})), ATP‑linked respiration, maximal respiration (FCCP), proton leak.Интерпретация: падение NADH‑linked, восстановление при сукцинате → комплекс I; отсутствие ответа на TMPD/ascorbate → комплекс IV; FCCP‑индуцированное восстановление OCR → не ингибирование неизменного дыхательного механизма и т.д.

Измерение Δψm и АТФ

Δψm: TMRM, TMRE, JC‑1 (поправить на концентрацию), флуоресцентные протеиные сенсоры;ATP уровни: люминесцентные тесты (люцифераза), соотношение ATP/ADP;Ожидаемое: ингибитор АТС‑синтазы → высокий Δψm + низкий ATP; ункуполер → низкий Δψm + падение ATP.

Активности отдельных комплексов (биохимические тесты)

Спектрофотометрические/электрохимические измерения in vitro:
Комплекс I: NADH→ubiquinone‑зависимая активность (децифрование чувствительностью к ротенону);Комплекс II: сукцинат‑цитохром c редуктаза;Комплекс III: антимицин‑чувствительная активность;Комплекс IV: цитохром c оксидаза (TMPD/ascorbate);Определение кинетики (Km), (V{\max}) для поражённых ферментов: (Km), (V{\max}).

ROS и окислительные маркеры

MitoSOX (митохондриальный супероксид), Amplex Red (H2O2);Липидная пероксидация: MDA (TBARS), 4‑HNE, масс‑спектрометрия кардиолипина;Снижение активности при антиоксидантной пре‑обработке укажет на ROS‑опосредованный эффект.

Структурные и молекулярные методы

Blue‑native PAGE / 2D‑PAGE для оценки суперкомплексов;Вестерн‑блот: уровни субъединиц комплексов, цитохром c в митохондриях/цитозоле;Масс‑спектрометрия/протеомика: посттрансляционные модификации (нитрозилирование, карбонилирование, глутатионилирование);Локализация и целостность мембран (электронная микроскопия).

mPTP, мембранная проницаемость и Ca2+

Наполнение Ca2+ (calcium retention capacity), тест на набухание митохондрий; ингибитор: цикоспорин A для проверки mPTP‑опосредованного эффекта.

CoQ/редокс‑ста́тус и метаболические маркёры

HPLC/LC‑MS для определения уровня и степени окисления CoQ;NADH/NAD+ измерения, флуоресцентные сенсоры (Peredox, SoNar) для оценки редокс‑состояния.

Молекулярные и клеточные подтверждения

qPCR для mtDNA повреждений; транскриптомика/протеомика для проверки компенсации;Комбинация in vitro (изолированные митохондрии) и in situ (пермеабилизированные клетки, живые клетки) — помогает отличить прямой митохондриальный эффект от эффектов на цитоплазматические пути.

Контрольные эксперименты и интерпретация

Использовать известные специфичные ингибиторы/антидоты: ротенон (CI), анти‑/светофор (CIII), олигомицин (АТФ‑синтаза), FCCP (ункуполер), цитохром c, цикоспорин A (mPTP), антиоксиданты (MitoQ, NAC) — смотреть, восстанавливают ли они функцию.Дозово‑временная зависимость, восстановимость после удаления токсина, сравнение с изолированными митохондриями → определит прямой/косвенный механизм.

Краткая стратегия для работы в лаборатории

Измерить OCR в клетках (Seahorse) — получить профиль (basal, ATP‑linked, maximal, spare).SUIT‑респирометрия на митохондриях/пермеабилизованных клетках — локализовать блок.Спектрофотометрические тесты комплексов + Δψm + ATP — подтвердить биохимически.ROS, кардиолипин, BN‑PAGE, цитохром c release, mPTP‑тесты — уточнить механизм повреждения.Rescue‑эксперименты с ингибиторами/антидотами и молекулярные анализы.

Если нужно, могу составить конкретный пошаговый протокол SUIT‑теста или список реагентов/параметров измерения для выбранного типа клеток/митохондрий.