Коротко: разные оптимумы pH у пепсина и трипсина обусловлены химией и состоянием их каталитических остатков и структурной устойчивостью в соответствующей среде; изменение pH меняет протонирование активных групп, электростатику сайта связывания и стабильность конформации — вследствие этого изменяются $k_{cat}$, $K_M$ и специфичность.
Почему пепсин активен при низком pH
- Пепсин — аспартатная протеаза: в активном центре две аспарагиновые кислоты (в пепсине часто обозначают Asp32 и Asp215), одна должна быть протонирована, другая — депротонирована, чтобы обеспечить каталитическое гидролитическое действие (кислотно-основный механизм). Это реализуется только в кислой среде.
- Низкий pH стабилизирует конформацию пепсина (он эволюционно приспособлен к желудочному соку) и препятствует автокатализу/неправильной активации до нужной формы (пепсиноген → пепсин активируется кислотой).
- Оптимум: $p{H}_{opt}\approx 1.5\text{–}2$.
Почему трипсин активен при нейтрально-щелочном pH
- Трипсин — сериновая протеаза с каталитической триадой His57–Asp102–Ser195 (нумерация по химо/трипсину). Для того чтобы His функционировал как основание и отобрал протон у Ser195, His должен быть в депротонированной форме. Поскольку pK_a у His ≈ $6.0$, при нейтрально-щелочном pH его доля депротонированной формы больше, что обеспечивает активность.
- Сайт специфичности трипсина содержит отрицательно заряженную карбоксильную группу (Asp189), которая связывает положительные боковые цепи Lys/Arg у субстрата; при слишком низком pH эта Asp может быть протонирована и теряет способность узнавать базовые остатки.
- Оптимум: $p{H}_{opt}\approx 7.5\text{–}8.5$.
Структурные и химические факторы
- Протонирование/депротонирование активных остатков (Asp, His, Lys и др.) определяет способность участвовать в переносе протонов и стабилизации переходного состояния. Формулы: Henderson–Hasselbalch
$$pH=p{K}_a+\log \frac{[A^{-}]}{[HA]}$$ Доля депротонированной формы:
$$f_{A^{-}}=\frac{1}{1+10^{p{K}_a-pH}}.$$ - Электростатические взаимодействия и сольвентная оболочка: изменение заряда нарушает сольвые мосты и внутримолекулярные связи → денатурация или изменение конформации.
- Специфичность определяется зарядом и формой субстратного кармана; изменение pH меняет зарядовую комплементарность.
Влияние нарушения pH на кинетику и специфичность
- Скорость реакции описывается уравнением Михаэлиса–Ментен:
$$v=\frac{V_{\max }[S]}{K_M+[S]},V_{\max }=k_{cat}[E{]}_T.$$ - Изменение pH меняет:
- $k_{cat}$ — через влияние на химическую стадую (протонный обмен в активном центре); обычно падает при неправильном протонировании каталитических остатков.
- $K_M$ — через изменение сродства связывания (электростатика и конформация) — обычно $K_M$ растёт (меньшая аффинность) при неблагоприятном pH.
- Следовательно каталитическая эффективность $\frac{k_{cat}}{K_M}$ обычно снижается вне оптимума.
- Активность по pH часто имеет «колоколообразную» форму, контролируемую протонированием двух (или более) групп:
$$Activity(pH)\propto \frac{1}{1+10^{p{K}_{a1}-pH}}\cdot \frac{1}{1+10^{pH-p{K}_{a2}}}.$$ - Специфичность меняется, если остатки в сайте связывания теряют/приобретают заряд → предпочтения по субстратам (например, трипсин теряет притяжение к Lys/Arg при низком pH).
- При сильном отклонении pH возможна необратимая денатурация (разрыв дисульфидов, распад третичной структуры), что резко уменьшает или полностью выключает активность.
Краткое резюме
- Пепсин оптимален при низком pH, потому что его каталитический механизм требует специфичного протонирования аспартатов и он структурно стабилен в кислой среде.
- Трипсин требует депротонированного His и отрицательно заряженного кармана для связывания базовых остатков — поэтому он работает при нейтрально-щелочном pH.
- Нарушение pH меняет протонирование ключевых остатков, электростатику и конформацию → влияет на $k_{cat}$, $K_M$ и специфичность, вплоть до денатурации.