Кратко и по существу.
Формулы для интерпретации
- Михайлов — Менделеев: $v=\frac{V_{\max }[S]}{K_m+[S]}$.
- Связь Vmax с kcat: $V_{\max }=k_{\mathrm{cat}}[E{]}_T$.
- Для простого механизма $E+S\underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{}}ES\stackrel{k_2}{}E+P$:
$K_m=\frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$ и $k_{\mathrm{cat}}=k_2$ (при этом $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ — каталитическая эффективность).
Как мутация в активном центре может менять Km и Vmax — основные механизмы (структурные причины)
1. Изменение сродства к субстрату (влияет на $K_m$):
- прямая утрата контактов (водородные связи, ионные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы) → увеличение $k_{-1}$ или уменьшение $k_1$ → $K_m$ растёт;
- стерические помехи или изменённая геометрия кармана → хуже связывание (увеличение $K_m$);
- обратный эффект — консервативная замена, создающая дополнительную стабилизацию, может уменьшить $K_m$.
2. Изменение химии переходного состояния (влияет на $k_{\mathrm{cat}}$ и потому на $V_{\max }$):
- нарушение каталитических остатков (кислота/основание, нуклеофилы) → снижение способности стабилизировать переходное состояние → снижается $k_{\mathrm{cat}}$;
- смещение позиционирования каталитического остатка (геометрия, расстояния, углы) — снижение скорости химического шага;
- нарушение координации металла‑катализатора → падение активности;
3. Изменение динамики и конформационного обмена:
- изменение гибкости активного центра может тормозить необходимые перестройки (индуцируемая подгонка) → уменьшение $k_{\mathrm{cat}}$ или изменение $K_m$;
- затруднённый выход продукта (product release) — если лимитирующий шаг релиз, $V_{\max }$ падает, $K_m$ может незначительно меняться;
4. Электростатика и pKa сдвиги:
- замена заряженных остатков меняет pKa катализирующих групп → изменение pH-зависимости скорости и сниженный $k_{\mathrm{cat}}$ при рабочих pH;
- изменение локальной диэлектрической среды влияет на стабилизацию переходного состояния.
5. Косвенные эффекты (второй круг остатков):
- мутация не в контактной позиции, но меняющая структуру кармана — может изменить и $K_m$, и $V_{\max }$.
Как интерпретировать типичные наблюдения
- Увеличение $K_m$, неизменный $V_{\max }$ → проблема связывания (изменён $k_1$ или $k_{-1}$), сам химический шаг сохранён.
- Снижение $V_{\max }$ (или $k_{\mathrm{cat}}$), неизменный $K_m$ → химический шаг или релиз продукта замедлены, связывание несущественно изменилось.
- Одновременное снижение $k_{\mathrm{cat}}$ и изменение $K_m$ → комбинированный эффект на связывание и химию.
Экспериментальные подходы для проверки гипотез (порядок и что дают)
1. Подготовка:
- site‑directed mutagenesis (целевые замены: консервативные и неконсервативные), очистка белка; оценить активную долю белка.
2. Контроль свёртывания/стабильности:
- CD спектроскопия, DSC/DSF — исключить глобальную денатурацию как причину изменения кинетики.
3. Стандартная кинетика (стационарный режим):
- измерить полные кинетические кривые (v vs [S]) → получить $K_m$, $V_{\max }$, $k_{\mathrm{cat}}$ и $k_{\mathrm{cat}}/K_m$.
- корректировка на активную концентрацию фермента.
4. Пред‑стационарная кинетика (stopped‑flow, quench‑flow):
- выявить дискретные шаги: быстрый «burst» указывает на медленный релиз; позволяет разделить k2 vs k3 и т. п.
5. Изотопные эффекты и pH‑профили:
- раствор‑изотопный эффект (H/D) — если химия разрушается, KIE изменится;
- pH‑зависимость $k_{\mathrm{cat}}$ и $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ — показывает сдвиги pKa каталитических групп.
6. Биндинговые измерения:
- ITC, SPR, флюориметрия связывания с ненаблюдаемой каталитической реакцией — прямое измерение Kd; сравнение Kd и Km помогает отличить вклад связывания и катализа (Km ~ Kd при $k_2\ll k_{-1}$ не всегда).
7. Структурные методы:
- X‑ray кристаллография или cryo‑EM (с субстратом/аналогом/инхибитором) — увидеть изменения геометрии, расстояний, координации;
- NMR (для малых ферментов) и HDX‑MS — оценка локальной динамики.
8. Вычисления:
- MD и QM/MM расчёты переходного состояния, оценки энергий активации, влияние мутации на распределение конформаций.
9. Химическое «rescue» и вторичные мутации:
- восстанавливающие добавки (например, добавить малую молекулу, компенсирующую потерю функции) или селективные компенсирующие (suppressor) мутации для подтверждения механистической роли остатка.
Практическая стратегия проверки гипотезы (примерный план)
1. Сделать 2–3 варианта мутаций (консервативная, неконсервативная) на предполагаемом каталитическом остатке.
2. Проверить свёртывание и стабильность.
3. Измерить Km и Vmax (стационарно). Если изменилось только Km — преимущественно проблема связывания; если Vmax упал — химия/релиз.
4. При падении Vmax выполнить stopped‑flow и KIE; сделать pH‑профили.
5. Параллельно получить структуру мутанта (+ лига́нд) или провести MD/QM‑MM для проверки смещения остатков/координации металла.
6. При подозрении на потерю электростатики — попытаться химическим rescue (например, добавить имитатор кислоты/основания) или выполнить второй мутационный экран.
Короткие правила интерпретации результатов
- Сильное падение $k_{\mathrm{cat}}$ (на порядки) при почти неизменном $K_m$: ключевой каталитический остаток повреждён.
- Большое увеличение $K_m$ при малом изменении $k_{\mathrm{cat}}$: потеря контактов связывания.
- Снижение $k_{\mathrm{cat}}/K_m$: потеря способности стабилизировать переходное состояние или ухудшение встречаемости корректной энзим‑субстрат конфигурации.
Если нужно, могу предложить конкретный экспериментальный план для вашей конкретной ферментной системы (указать тип фермента, предполагаемый остаток, наличие металлов и желаемые методы).