Кратко и по существу — что и как измеряют, какие уравнения используют и как по результатам судят о механизме.
1) Сбор экспериментальных данных
- Начальные скорости: измеряют начальные скорости $v_0$ при матричном изменении концентраций всех субстратов (для двух субстратов — сетка $[A{]}_i\times [B{]}_j$). При этом сохраняют: начальные условия (малая конверсия), постоянный pH, ионную силу и т. п.
- Прогресс‑кривые и пред‑стационарная кинетика: stopped‑flow, quenched‑flow для выделения быстрых промежуточов и «burst»‑фаз.
- Продуктовая индукция/ингибирование и «dead‑end» ингибиторы: измеряют влияние продуктов или нереактивных аналогов на скорость.
- Кинетические изотопные эффекты (KIE): заменой атомов (H→D, 12C→13C) выявляют, вовлечена ли разрыв/образование связи в РШ.
- Температурные серии: измеряют константы при нескольких $T$ (обычно 5–10 точек).
2) Первичная обработка — порядок и вид зависимости
- Аппараентные порядки: лог‑лог‑построение $\log v$ vs $\log [S]$ при избытке других реагентов даёт степенные показатели (апп. порядки).
- Двойные‑ревипроцные (Lineweaver–Burk) или лучше нелинейная регрессия: строят семейства прямых при варьировании одного субстрата и фиксировании другого. Поведение для двухсубстратных реакций:
- пересекающиеся линии → последовательный механизм (sequential, ordered или random);
- параллельные линии → ping‑pong (double‑displacement).
3) Математические модели и нахождение параметров
- Используют стационарные уравнения (King–Altman или Michaelis–Menten‑подобные) соответствующих механизмов и выполняют глобальную нелинейную подстановку (одновременный фит всех матриц данных) для извлечения параметров $V_{\max }$, $K_m$/$K_i$ и микроконстант. Пример для двухсубстратного последовательного механизма (общий вид):
$$v=\frac{V_{\max }[A][B]}{K_{ia}{K}_b+K_b[A]+K_a[B]+[A][B]}.$$ Для ping‑pong форма отличается (характерные вкладные члены дают параллельные двойные‑реципрочные линии).
- Предпочтительна нелинейная регрессия (минимизация SSE, доверительные интервалы, AIC для выбора модели) вместо линеаризаций.
4) Получение микроконстант и механизмов
- Если модель‑стадия простая (несколько элементарных шагов), глобальная подгонка даёт макроконстанты и, при наличии дополнительных ограничений (например, независимые измерения констант связывания), позволяет оценить отдельные микроконстанты $k_1,k_{-1},k_2$ и т. д.
- Пред‑стационарные эксперименты (burst kinetics, stopped‑flow) позволяют выделить быстрые и медленные шаги и напрямую измерить константы переходных стадий.
- Продуктовое ингибирование и «dead‑end» ингибиторы дают информацию о порядке образования/высвобождения субстратов и о том, какие комплексы устойчивы — помогают отличить order vs random и показать наличие ковалентных промежуточов (ping‑pong).
- KIE: большой первичный KIE указывает, что разрыв C–H (или подобной) лежит в элементарном (скоростном) шаге.
5) Температурная зависимость — энергия активации и термодинамические параметры переходного состояния
- Измеряют $k$ при разных $T$ и используют Arrhenius:
$$\ln k=\ln A-\frac{E_a}{RT},$$ где наклон графика $\ln k$ против $1/T$ даёт $-E_a/R$.
- Для оценки $\Delta H^{‡}$ и $\Delta S^{‡}$ применяют уравнение Эйринга:
$$\ln \left(\frac{k}{T}\right)=-\frac{\Delta H^{‡}}{RT}+\ln \left(\frac{k_B}{h}\right)+\frac{\Delta S^{‡}}{R}.$$ Эти величины помогают отличать энтропийно контролируемые и энтальпийно контролируемые шаги и сужают возможные механистические гипотезы.
6) Как всё это помогает выявить механизм — практическая логика
- Шаблон двойных‑реципрочных линий (пересекающиеся vs параллельные) → последовательный vs ping‑pong.
- Результаты продуктового ингибирования и dead‑end ингибиторы уточняют порядок связывания/высвобождения.
- Наличие или отсутствие burst‑фазы указывает на скорость химического шага по сравнению с релизом продукта.
- KIE и температурные параметры локализуют, какой именно элементарный шаг является лимитирующим (например, перенос протона/электрона vs конформационный переход).
- Совместная глобальная подгонка экспериментальных матриц к конкретной механистической модели и статистическая оценка качества (остатки, доверительные интервалы, сравнение AIC для разных моделей) позволяет выбрать наиболее правдоподобный механизм и оценить микроконстанты.
Резюме: экспоненциально надёжнее — собрать матрицу начальных скоростей при разных концентрациях субстратов, провести продуктовые/dead‑end ингибиторные эксперименты, использовать пред‑стационарные методы и KIE, затем глобально фитировать соответствующие кинетические уравнения; температурные серии дают $E_a,\Delta H^{‡},\Delta S^{‡}$. Сопоставление этих результатов позволяет однозначно или с высокой степенью вероятности выбрать механизм и извлечь микрокинетические параметры.