Кратко — сначала общие механизмы катализа, затем как мутации в активном центре меняют кинетику с конкретными примерами.
Механизмы ферментативного катализа (основные принципы)
- Стабилизация переходного состояния — активный центр снижает $\Delta G^{‡}$ за счёт специфических взаимодействий (водородные связи, ионные взаимодействия, дипольное выравнивание).
- Ковалентный катализ — образование промежуточного ковалентного комплекса между субстратом и остатком фермента (например, сериновая нуклеофилия).
- Общий кислотно-основной катализ — остатки (His, Glu, Asp, Lys) переносят протоны, облегчая разрыв/образование связей.
- Металло-катализ — ионы металлов (Zn2+, Mg2+, Fe2+/3+) активируют субстрат или стабилизируют заряды.
- Проксимация и ориентация — фермент правильно ориентирует реагирующие группы и уменьшает энтропийные потери.
- Силовое/стрессовое искажение субстрата — искажает субстрат в сторону переходного состояния.
- Электростатическая стабилизация (окса́нионная ямка и т.п.) — полевые эффекты, повышающие скорость реакции.
Кинетические параметры и связь с энергией активации
- Михаэлисово–Ментеново уравнение: $v=\frac{V_{max}[S]}{K_M+[S]}$, где $V_{max}=k_{cat}[E{]}_0$.
- Каталитическая эффективность: $\frac{k_{cat}}{K_M}$ — важна при низких концентрациях субстрата.
- Зависимость скорости от энергии активации (Eyring/Arrhenius): $k\propto e^{-\Delta G^{‡}/(RT)}$. Соответственно изменение активационной энергии $\Delta \Delta G^{‡}$ даёт изменение скорости: $\frac{k_{mut}}{k_{wt}}=e^{-\Delta \Delta G^{‡}/(RT)}$.
Как мутации в активном центре меняют кинетику (механизмы и типичные эффекты)
- Нарушение химической функции (например, удаление нуклеофильной группы): уменьшает $k_{cat}$ (химический этап становится медленнее). Пример: замена серина нуклеофила в сериновых протеазах (Ser→Ala) резко уменьшает $k_{cat}$ (часто на многие порядки).
- Утрата кислотно-основной функции (His/Asp/Glu → Ala/Gln): снижает скорость протонирования/депротонирования, увеличивает $\Delta G^{‡}$ и снижает $k_{cat}$.
- Нарушение стабилизации переходного состояния (окса́нионная ямка, донорно‑акцепторные Н‑связи): главным образом снижает $\frac{k_{cat}}{K_M}$ и/или $k_{cat}$ в зависимости от того, что лимитирует скорость. Пример: мутации остатков, формирующих окса́нионную ямку в трипсине/химотрипсине, уменьшают каталитическую активность и повышают энергию активации.
- Изменение сродства связывания субстрата: если мутация ухудшает связывание в исходном состоянии, $K_M$ увеличивается; если ухудшает связывание переходного состояния — падает $\frac{k_{cat}}{K_M}$.
- Утрата/изменение координации металла: в металлозависимых ферментах (например, карбоангидраза, металлопротеиназы) замена лигандирующих His/Asp → Ala снижает или устраняет активность (падает $k_{cat}$, может измениться $K_M$).
- Аллостерические и структурные эффекты: мутации, меняющие конформационную гибкость или доступ активного центра, могут увеличивать энтропийный барьер (влияние на $k_{cat}$ и на $K_M$).
Конкретные примеры
- Сериновые протеазы (триада His-Asp-Ser): замена Ser195→Ala приводит к резкому падению $k_{cat}$ (часто на 10^4–10^8 раз), потому что ковалентная фосфорификация/нуклеофилия невозможны. При этом $K_M$ может измениться меньше, поскольку связывание субстрата остаётся частично.
- Oксанионная ямка (чрезвычайно важна для стабилизации тетрагонального промежуточного состояния у сериновых протеаз/субтилизина): мутация аминокислот, формирующих Н‑доноры, повышает $\Delta G^{‡}$ и снижает $\frac{k_{cat}}{K_M}$.
- Металлозависимые ферменты: замена лигандирующего His → Ala в карбоангидразе уменьшает скорость катализа (падение $k_{cat}$), так как Zn2+ уже не активирует воду.
- Клинический пример — мутации в активном центре HIV‑1 протеазы: некоторые замены уменьшают связывание ингибитора (увеличение $K_i$) и одновременно могут менять $k_{cat}$ или $K_M$, что приводит к резистентности при сохранении достаточной каталитической активности вируса.
Интерпретация изменений параметров
- Снижение только $k_{cat}$ → проблема химического шага (каталитическая химия, перенос протона, ковалентный этап).
- Увеличение только $K_M$ → ухудшено исходное связывание субстрата (или ускорённый выход продукта).
- Снижение $\frac{k_{cat}}{K_M}$ → потеря способности стабилизировать переходное состояние.
- Комбинации изменений дают представление о том, какую функцию выполнял мутируемый остаток.
Короткая практическая формула связи между изменением энергии и изменением скорости:
$\frac{k_{mut}}{k_{wt}}=e^{-\Delta \Delta G^{‡}/(RT)}$.
Вывод: мутации в активном центре действуют через конкретные механизмы — утрату нуклеофилии, кислотно‑основной роли, координации металла или стабилизации переходного состояния — что проявляется в изменениях $k_{cat}$, $K_M$ и $\frac{k_{cat}}{K_M}$. Эти параметры помогают диагностировать, какую именно функцию нарушила мутация.