Ниже — набор конкретных факторов и практических мер, которые можно изменить на разных уровнях (транскрипция, трансляция, пост‑трансляционные процессы и условия культивирования), чтобы повысить экспрессию и получить правильно свёрнутый активный белок в дрожжах. Для удобства — сначала краткая схема действий, затем детали и рекомендации по приоритетам экспериментов.

Краткая стратегия (приоритеты)

Оценить, где проблема — низкая транскрипция, малый уровень белка (процессы трансляции/деградации) или неправильная свёртка/обработка (ER/секреция). (qPCR, вестерн, секреция)Попробовать кодонную оптимизацию/гармонизацию + разные промоторы/копии гена.Модулировать скорость трансляции и ко‑трансляционную укладку (5'UTR, редкие кодоны, понижение температуры).Усилить аппараты свёртки/секреции (соупрессия шаперонов, PDI, ERO1, HAC1), использовать подходящий сигнальный пептид.Оценить и корректировать N‑/O‑гликозилирование и образование дисульфидных мостов; использовать протеазо‑дефицитные/глико‑реинженерные штаммы.Тестировать фьюж‑партнёры (MBP/SUMO/IgG Fc) и условия культивирования (температура, индукция, добавки).

Детали по уровням

1) Транскрипция — как повысить уровень мРНК и стабильность транскриптов

Промотор: выбрать сильный/регулируемый промотор (в S. cerevisiae — TEF1, PGK1, CUP1, GAL1; в Pichia — AOX1 для индукции метанолом). Иногда слабее промотор даёт более качественную продукцию (меньше агрегации) — тестируйте несколько.Копийность гена и локус интеграции: многократные интеграты или плазмида высокой копии повышают экспрессию, но могут нагружать систему; оптимизируйте число копий и место интеграции (активная хроматиновая зона).Терминаторы/3'UTR: используйте сильные терминаторы для стабильности мРНК (например CYC1 terminator). Избегайте последовательностей, вызывающих быстрое расщепление.Хроматиновая структура: выбор места интеграции в «активную» область; использовать элементы улефтов (insulators) при необходимости.Управление стрессом транскрипции: если экспрессия вызывает UPR, переключитесь на индукционный промотор или снизьте силу промотора.

2) Трансляция и ко‑трансляционная укладка

Кодонная оптимизация vs гармонизация: оптимизируйте кодоны под дрожжевый тРНК пул, но учитывайте, что слишком быстрая трансляция может нарушить укладку. Codon harmonization (сохранение пауз) иногда повышает правильную свёртку.5'UTR / контекст старта: оптимизация контекста начала (Kozak‑подобная последовательность/оптимальный 5'UTR) для улучшения и/или контроля инициации.Уменьшение вторичной структуры мРНК в районе начала трансляции и рибосомного входа повышает переводимость.Контроль скорости трансляции: введение редких кодонов в критические участки для «паузы» и правильной укладки доменов; или добавление/удаление "linker" последовательностей.Титры тРНК: при использовании редких кодонов можно коэкспрессировать соответствующие тРНК.Сигнальные пептиды и секреция: для секретируемых белков используйте оптимальный сигнал (α‑factor prepro в S. cerevisiae или native signal в Pichia). Неправильный сигнал даёт неполную проходимость через ER и неверную обработку. Убедитесь в корректной Kex2/субстратабельности сигнала.Фьюж‑партнёры (MBP, SUMO, GFP, Trx, Fc): увеличивают растворимость и помощают свёртке; после очистки удаляются протеазой.

3) Посттрансляционные факторы и обработка (ER, гликозилирование, дисульфиды)

Шапероны и фолдосомы: коэкспрессия BiP/Kar2, PDI (protein disulfide isomerase), ERp57, calnexin/calreticulin может сильно повысить долю корректно свернутого белка.Повышение окислительной способности ER: Ero1p повышает образование дисульфидных связей.Управление UPR: аккуратная активация UPR (коэкспрессия активной формы транскриптора HAC1) увеличивает ёмкость аппарата свёртки.ERAD и деградация: снижение активности ERAD (ослабление HRD1/DER1) может уменьшить преждевременную деградацию, но осторожно — уязвимость к накоплению дефектных белков.Гликозилирование: дрожжи сильно маннозилируют (S. cerevisiae) — это может влиять на активность. Решения:
Удалить/мутировать несущественные N‑гликозилируемые сайты.Использовать гигкоинженерные штаммы (glycoengineered Pichia / S. cerevisiae) для более «человеческой» гликировки.Контролировать местоположение гликозилирования — иногда глики работают против правильной укладки.Протеазы: использовать протеазо‑дефицитные штаммы (pep4Δ, prb1Δ в S. cerevisiae) или добавлять ингибиторы протеаз в процессинг/добычу.Ретенция в ER: добавление ER‑retention сигнала (HDEL/KDEL) удерживает белок в ER, где аппараты фолдинга более развиты; полезно если секрецируемый белок неправильно обрабатывается в Golgi.Разрезание и процессинг: убедитесь, что пептидазы (Kex2) корректно обрабатывают предшественники; при необходимости отредактируйте сайт расщепления.

4) Условия выращивания и процессинг

Температура: снижение температуры экспрессии (20–25°C вместо 30°C) часто снижает агрегацию и улучшает фолдинг.Скорость роста и режим индукции: медленное наращивание экспрессии, постепенная индукция (низкая концентрация индуктора) даёт лучшее качество.Кормление/реактор: управление DO, pH, режимом питания (Fed‑batch) — важны для стабильной экспрессии.Добавки: химические шапероны/осмопротекторы (глицерин, сорбитол, бетаин) иногда помогают; осторожно с восстановителями (DTT) — они нарушают дисульфиды.Время выборки: оптимизация времени сбора после индукции — иногда активность максимальна не при пике уровня белка.

5) Протеиноинженерия

Мутации для повышения стабильности: замена отдельных аминокислот, удаление агрегационных мотивов, стабилизация доменов.Удаление/модификация гликозилируемых участков, нестабильных петель и лишних цистеинов (если не нужны).Замена N‑/C‑терминальных участков, вставка гибких линкеров, создание гибридов (Fc‑фьюжн для секретируемых белков) — облегчает очистку и повышает растворимость.

6) Диагностика — какие тесты проводить

qPCR/RT‑qPCR для уровня мРНК.Вестерн/иммуноблот для общего белка; анализ секретируемого/ внутриклеточного фракций.Стационарная активность (functional assay) — основной критерий.SDS‑PAGE ± восстановление (для дисульфидов), масс‑спектрометрия для гликозилирования.Пульс‑чейс (pulse‑chase) для изучения скорости секреции и деградации.Аггрегация (solubility assays), динамический светорассеяние или размерная фильтрация.UPR/стресс‑маркер: уровень Kar2/BiP, HAC1 сплайсинг.

Практический план экспериментов (пример)

Определить причины: RT‑qPCR + вестерн + секреция — понять, на каком этапе падает выход.Параллельный скрининг конструкций:
2–3 промотора (сильный, умеренный, индукционный)2 варианта сигнального пептида (α‑factor, нативный)кодонная оптимизация vs гармонизацияфьюж‑партнёр (например SUMO) и безКо‑экспрессия шаперонов в матричных условиях: PDI + BiP ± HAC1.Понижение температуры и медленная индукция для лучших условий свёртки.При необходимости — перейти на другой штамм (Pichia pastoris для секреции и высоких выходов; glycoengineered штаммы при необходимости человеческой гликозилировки) и/или использовать протеазо‑дефицитные варианты.Анализ качества (активность, гликозилирование, дисульфиды) и оптимизация на основе результатов.

Риски и компромиссы

Сильное повышение транскрипции/копийности может привести к перегрузке ER и увеличению неферментативной продукции — тогда понадобится увеличивать фолдинг‑аппараты.Понижение ERAD может повысить количество белка, но ухудшить качество и клеточную физиологию.Кодонная оптимизация может повысить уровень, но ухудшить фолдинг — поэтому тестировать обе стратегии (оптимизация vs гармонизация).

Если хотите, могу:

предложить конкретный протокол/комбинации промоторов/сигнальных пептидов и шаперонов для S. cerevisiae или P. pastoris с расчётом приоритетов для вашего белка;помочь составить план экспериментов с контролями и методами аналитики (qPCR, western, activity assay).

Напишите, какой это белок (секретируемый/цитозольный, есть ли дисульфиды или места N‑гликозилирования), в каком штамме вы работаете и какие у вас уже есть данные (уровень mRNA, белка, активность) — дам более конкретные рекомендации.