Ниже — системный разбор возможных причин снижения выхода и накопления «неправильной» формы белка у трансгенной дрожжевой культуры $S.cerevisiae/другиедрожжи$, какие тесты провести для диагностики и какие исправления/манипуляции попробовать. Сгруппировано по этапам экспрессии и путям качества $DNA\to mRNA\to трансляция\to транслокация/секреция\to сворачивание/модификации\to деградация/клеточнаяфизиология$.

1) Генетика, конструкция экспрессии

Возможные нарушения:
мутации в вставке $рамкасчитывания,стоп-кодоны,точкисплайсинга$нестабильность плазмиды/инсерта, потеря копий, промотор слишком сильный/слабыйДиагностика:
Sanger/NGS секвенирование вставки и фланкирующих участковqPCR для числа копий / проверка наличия плазмидыконтроль промотора $reporter,RT-qPCR$Исправления:
исправить последовательность; использовать копию с оптимизированной последовательностьюизменить промотор/копийность $снизитьперегрузкусистемысильнымпромотором$переключиться на интеграцию в геном в стабильное место

2) Транскрипция и стабильность мРНК

Возможные нарушения:
низкая транскрипция или нестабильная мРНК $прибегаетдеградации$криптические сайты сплайсинга/полиаденилирования $еслииспользованычужеродныеучастки$Диагностика:
RT-qPCR / Northern blot — уровни мРНК5' и 3' RACE для проверки границ транскриптаанализ сплайсинга при наличии интроновИсправления:
замена/оптимизация промотора, изменение 5'UTR/3'UTR для стабильностиудаление проблемных сигналов, оптимизировать терминаторы

3) Трансляция $инициация,элонгация,кодоннаяоптимизация$

Возможные нарушения:
плохая инициация $структурыв5^{\prime }UTR$, редкие кодоны → рибосомные паузы/столкновенияранние падения трансляции — фрагментация белкаДиагностика:
полисомный профиль / polysome profiling — статус трансляцииribosome profiling $Ribo-seq$ для точного местоположения стопов/заторованализ последовательности: частота тРНК/редкие кодоны и предсказание вторичной структуры мРНК у старт-кодонаИсправления:
кодонная оптимизация под дрожжи $безизмененияфункциональности$изменения 5'UTR снять сильно структурные участки, включить эффективный лидерзамедлить трансляцию в критических местах $слабеередкиекодоны$ для корректного сворачивания

4) Сигнальная последовательность и транслокация в эндоплазматический ретикулум $длясекретируемыхбелков$

Возможные нарушения:
некорректный signal peptide → белок остаётся в цитозоле/частично встраивается в мембрануплохая транслокация/задержка в мембране ERнекорректная обработка сигнал-пептида $Kex2/Ste13дляalpha-factor$Диагностика:
секреция: анализ культуральной жидкости vs клеточных фракций $веществовсупернатанте?$флуоресцентная микроскопия с фьюжном GFP / иммунокраснение $локализациявER,Golgi,вакуоли$анализ N-конца белка $мас-спектрометрия,Edman$ — проверка отщепления сигнального пептидаEndoH/PNGase и реакции на обработку $есливER$Исправления:
заменить/оптимизировать сигнал-пептид $частоиспользуютalpha-factorpreproleaderдляS.cerevisiae$скорректировать последовательности Kex2/Ste13 sites или использовать альтернативные лидерыснижение скорости синтеза/коэкспрессия компонентов секреции $SEC$, чтобы избежать «заторoв»

5) Сворачивание в ER, шапероны, дисульфидные связи и окислительное фолдинг

Возможные нарушения:
недостаточная помощь шаперонов $BiP/Kar2$, PDI → неправильная укладка, агрегатынеправильные дисульфидные мосты, избыточное восстановление/редуцированиенесоответствующие N‑ или O‑гликозилированияДиагностика:
выявление UPR $активацияsplicingHAC1,повышениеKAR2/BiPпоRT-qPCR/Western$co-immunoprecipitation с шаперонами $пойманныенепросвёрнутыебелки$нерастворимые агрегаты при центрифугировании; анализ на нитроцеллюлозе $вестерн$ в нерастворимой фракцииэлектрофорез с восстановлением/без восстановления для проверки дисульфидных соединенийИсправления:
коэкспрессия шаперонов и foldases: KAR2 $BiP$, PDI1, ERO1, LHS1, Hsp40/Hsp70 $SSA1идр.$изменение окислительного статуса ER $например,Ero1overexpression$ — осторожнопонижение температуры культивирования, добавление осмочересных агентов $глицерин$ или химических шапероновудалить/модифицировать проблемные цистеины или участки, вызывающие неправильные связи

6) Гликозилирование и другие посттрансл. модификации

Возможные нарушения:
неправильная/избыточная маноза-сборка у дрожжей делает белок неактивным/неправильной формыотсутствие нужных модификаций $например,учеловеческогобелка$Диагностика:
дегликозилирующие ферменты EndoH/PNGaseF и сравнение смещений в SDS-PAGEмасс-спектрометрия для картирования модификацийИсправления:
изменить/удалить сайты N‑гликозилирования $NxS/T$ при необходимостииспользовать strains с humanized glycosylation либо другой хост $Pichiapastoris/HEK$модификация путей гликозилирования $винженерныхлинияхдрожжей$

7) Трафик через Golgi / секреторный путь и внеклеточная деградация

Возможные нарушения:
задержка в Golgi, неправильная сортировка в вакуоль, протеолиз в секреционном пространстверасщепление сигналом протеаз, внешних/вакуолярныхДиагностика:
фракционирование клеток $ER/Golgi/вакуоль/культурал.среда$ + Western/blotингибирование протеаз в среде, добавление протеазных ингибиторов и смотреть изменение выходамутирование/анализ потенциальных сайтов протеолитического расщепления $мас-спектр$Исправления:
удалить/мутировать участки, чувствительные к протеазам; использовать protease-deficient штаммы $pep4\Delta ,prb1\Delta идр.$изменить секреционный сигнал на leader, обеспечивающий более быстрый выходповысить pH/иначе условия культуры, чтобы снизить активность протеаз

8) ER-associated degradation $ERAD$ и протеасомная деградация

Возможные нарушения:
белок не сворачивается → ретроградная транслюция и убиквитинирование → деградация протеасомойДиагностика:
применение ингибиторов протеасомы $MG132;вдрожжахприменениезатрудненоиз‑запроницаемости,новозможно$ или мутации proteasome components, и смотреть накоплениеобнаружение убиквитинированных форм $Westernсanti-ubiquitin$pulse–chase $метки35S$ для скорости деградацииИсправления:
улучшение сворачивания $коэкспрессияшаперонов$ вместо подавления ERADв крайних случаях временная генетическая модификация ERAD компонентов $осторожно—побочныеэффекты$

9) Агрегация/инклюзии/нерастворимость

Возможные нарушения:
образование внутриклеточных агрегатов/инклюзий, снижение лечебно‑активной формыДиагностика:
центрифугирование и анализ растворимой/нерастворимой фракции; TEM/микроскопияфильтрационные тесты, SDS‑/Native‑PAGE, Thioflavin/T aggregate stainsИсправления:
замедление синтеза $слабеепромотор,менеечастыйиндуктор$коэкспрессия расщепляющих шаперонов, снижение температуры, буферные добавки, модификация последовательности для повышения растворимости $мутации,фрагментация,добавлениесолюбилизационныхтеговMBP/Trx/GST—длясекрециитегиневсегдаподходят$перенос экспрессии в другой хост $Pichia,E.coliдляцитозоля,c\acute{e}lulasmam\acute{ı}feras$

10) Клеточная физиология / метаболический бёрден

Возможные нарушения:
перегрузка секреции → UPR, рост замедлен, снижается общий выход; недостаток тиолоксиредуктаз, окислительных коферментовДиагностика:
измерение роста, потребления питательных веществ, анализ UPR $Hac1splicing$измерение параметров ферментации $pO2,pH$Исправления:
оптимизация режима культивирования $температура,pH,аэрация$внедрение fed-batch, замедление скорости ростабалансировка выражения белка и шаперонов

Рекомендованный пошаговый диагностический план $быстрыйрабочийпротокол$

Проверить последовательность вставки и стабильность $секвенирование,qPCRнакопийность$.Измерить уровни мРНК $RT-qPCR$. Если низко — дело в транскрипции/стабильности.Определить, где находится белок: супернатант $секретирован$, клеточная периферия, ER/Golgi, вакуоль, цитозоль — фракционирование + western, или фьюжн‑GFP/микроскопия.Если белок в клетках и в неактивной форме — сделать pulse–chase для динамики синтеза/деградации и тест на убиквитинирование; проверить солюбильность $растворим/нерастворим$.Проверить марки UPR $HAC1splicing,KAR2$, коэкспрессию шаперонов, полисомы $приподозрениинапроблемытрансляции$.Исследовать гликозилирование $EndoH/PNGase,MS$ и N‑концевую обработку $сигнал$.На основании результатов: менять сигнал-пептид/кодонную оптимизацию/коэкспрессировать шапероны/удалять протеазы/ослаблять промотор/оптимизировать культуру.

Практические исправления, которые часто применяют и с большой вероятностью помогут:

Подбор/замена сигнала на alpha‑factor prepro leader $еслисекрециятребуется$.Кодонная оптимизация под дрожжи плюс удаление/модификация проблемных последовательностей $криптическиесайты,лишниецистеины,N‑гликосилирование$.Снижение темпа экспрессии $слабеепромоторилименьшеиндуцера$ для улучшения качества.Коэкспрессия KAR2 $BiP$, PDI1, ERO1 для улучшения фолдинга и дисульфидных связей.Использование protease-deficient штаммов $pep4\Delta /prb1\Delta$ для уменьшения деградации секрета.Снижение температуры культивирования, оптимизация условий ферментации.При необходимости — смена хоста $Pichiapastoris,илиeukaryoticcelllinechumanizedglycosylation$ если дрожжевые модификации неприемлемы.

Замечания и предостережения

Ингибирование ERAD или протеасомы может временно увеличить накопление, но приведёт к накоплению неправильных форм и стрессу — лучше улучшать фолдинг/трафик.Дефекты в glycosylation часто требуют либо изменения последовательности, либо использования иных штаммов/хостов.Любые генетические модификации шаперонов/ER-компонентов могут влиять на рост и общую продуктивность — проводить небольшие скрин-эксперименты.

Если хотите, могу:

предложить конкретный диагностический набор опытов $реагенты,контролы,времена$ в зависимости от того, какие инструменты у вас есть $Western,MS,pulse‑chase,Ribo‑seqит.д.$,помочь с анализом последовательности $проверкакодонов,signalpeptide,N‑гликозилирования,предсказаниевторичныхструктур5^{\prime }UTR$,порекомендовать штаммы и конкретные плазмидные конструкции/промоторы для S. cerevisiae или Pichia.

Скажите, какие данные у вас уже есть $местонакоплениябелка,Western/bands,последовательность,штамм$, и я предложу конкретную стратегию.