Краткий протокол исследования связи кишечного микробиома и депрессии (дизайн, методы, анализ, критерии причинности).
1) Дизайн исследования
- Многоуровневый: кросс‑секционный (открытие) + продольный (темпоральность: baseline, $4\text{–}12$ недель, $6$–$12$ мес) + интервенционный (RCT пробиотик/диета) + валидация в животной модели (FMT в безмикробных/антибиотик-очищенных мышах) + Mendelian randomization (MR) при наличии генетики хозяина.
- Рекомендуемые размеры выборок: открытие $n\ge 200$, репликация $n\ge 200$; минимум на грубо-диагностические сравнения $n\ge 100$ в группе для адекватной мощности при средних эффектах.
2) Сбор образцов и QC
- Стул: стандартизированный комплект, хранение при $-80^{\circ }\mathrm{C}$ как можно быстрее; фиксированные тайминги, запись приёма антибиотиков/пробиотиков в последние $3$ месяца.
- Контролы: отрицательные, мок‑комьюнити, технические реплики.
- Метаданные: возраст, пол, BMI, диета (FFQ), лекарственные препараты (особенно антидепрессанты, антибиотики, PPIs), курение, алкоголь, физическая активность, Bristol stool scale, воспалительные маркеры (CRP, IL-6).
3) Методы секвенирования и омics
- Таксономия:
- 16S rRNA (V3–V4) для широкого скрининга; целевая глубина $\ge 20,000$ чтений/образец.
- Shotgun метагеномика для видовой/функциональной резолюции; глубина $\ge 5,000,000\text{–}10,000,000$ чтений/образец.
- Функционал:
- Метатранскриптомика (опционально) для активности генов.
- Метаболомика плазмы/стула (LC‑MS/GC‑MS) для SCFA, триптофановых метаболитов, BDNF‑связаных молекул.
- Инструменты: DADA2/QIIME2 (ASV), MetaPhlAn/HUMAnN, MEGAHIT/MetaSPAdes, HUMAnN2/3, PICRUSt2 (предсказание), MaAsLin2/ANCOM‑BC/ALDEx2/Songbird для дифференциальной абундантности.
- Контроль батчей: рандомизация по батчам, коррекция (ComBat, mixed models).
4) Статистика и анализ (корреляции и ассоциации)
- Предобработка композиц. данных: remove low‑count features, CLR трансформация или Aitchison distance; избегать прямого использования относительных долей без учета композиционности.
- Альфа‑диво́рсность: Shannon, Simpson, observed ASVs; сравнение тестами (Wilcoxon, linear models).
- Бета‑диво́рсность: Bray–Curtis, weighted/unweighted UniFrac, PERMANOVA (adonis) с поправкой на ковариаты.
- Дифференциальная абундантность: ANCOM‑BC, ALDEx2, DESeq2 с CLR/offset; контролировать композиционность.
- Связь с клиническими шкалами (например HAM‑D):
- корреляции Спирмена/Pearsona в зависимости от нормальности; предпочтение частичным корреляциям или множественной регрессии с поправкой на конфаундеры (возраст, BMI, диета, лекарства).
- distance‑based redundancy analysis (dbRDA) для оценки доли вариации сообщества, объяснённой клиническими переменными (${\mathrm{R}}^2$ и p).
- Модельные подходы: смешанные эффекты для продольных данных, LASSO/elastic net, Random Forest / XGBoost с nested cross‑validation; интерпретация SHAP/feature importance.
- Множественное тестирование: Benjamini‑Hochberg (FDR) и репликация; критерий значимости $\mathrm{FDR}<0.05$.
- Отчётность эффектов: указывать коэффициенты регрессии, доверительные интервалы, объяснённую дисперсию (${\mathrm{R}}^2$) и минимально важный клинический эффект.
5) Параметры корреляции и статистические требования
- Выбираемые метрики:
- Корреляция между относительной/CLR‑преобразованной абундантностью и шкалами депрессии: используйте частичную корреляцию с ковариатами; тестируйте как непрерывную и как категориальную (диагноз) переменную.
- Ассоциации метаболитов ↔ микробные таксоны и клинические исходы: mediation analysis для проверки медиаторной роли метаболита.
- Порог значимости: $\mathrm{FDR}<0.05$; дополнительно репликация в независимой когорте.
- Мощность для корреляции: требуемый размер выборки для обнаружения корреляции $r$ можно оценить как $n\approx \frac{(Z_{1-\alpha /2}+Z_{1-\beta }{)}^2}{(\mathrm{atanh}(r){)}^2}+3$ (используйте конкретные $r,\alpha ,\beta$ для расчёта).
6) Контрольные группы
- Здоровые контролы, сопоставленные по возрасту/полу/BMI/диете/SES.
- Пациенты с другими психическими расстройствами (например, генерализованное тревожное) для специфичности.
- Депрессия: медикамент‑наивные, на терапии (разделять группы), рецидивы vs ремиссия.
- Событийные контролы: недавно принимавшие антибиотики (отдельная группа) для оценки эффекта антибиотиков.
7) Критерии причинно‑следственной интерпретации
Комбинация следующих доказательств для вывода о причинности:
- Темпоральность: изменения микробиома предшествуют изменению симптомов (доказательство из продольных данных).
- Репликация: воспроизводимость в независимых когортах и популяциях.
- Эксперимент: изменение симптомов после манипуляции микробиоты (RCT пробиотиков/пребиотиков/диеты, FMT в клинических испытаниях).
- Переносимость: передача фенотипа при FMT в животные (поведенческие и биомаркерные изменения).
- Доза‑ответ: градуированная зависимость (например, уровень метаболита или абундантность ↔ тяжесть депрессии).
- Биологическая правдоподобность: подтверждение механизмов (SCFA, триптофан‑метаболизм, HPA‑axis, иммунные пути).
- Неконфондирование: устойчивость ассоциации после жесткой корректировки на конфаундеры.
- Генетическое доказательство: MR, где генетические детерминанты микробиоты ассоциированы с депрессией.
- Статистические критерии: значимые и реплицируемые эффекты при $\mathrm{FDR}<0.05$, значимые медиаторные эффекты с доверительными интервалами, экспериментальные изменения с клинически значимым эффектом.
8) Порядок действий (pipeline)
- Реkrutирование + сбор метаданных → стандартизованный сбор стула → DNA/RNA extraction + QC → 16S/shotgun + метаболомика → preprocessing (DADA2/host removal) → CLR/Aitchison → diversity, differential abundance, multivariable models → longitudinal/mediation/causal inference → эксперименты (FMT, RCT) → MR.
9) Валидация и отчётность
- Предрегистрация протокола; скрипты и данные (с учётом приватности) для репродуцируемости.
- Отчёт всех ковариатов, критериев включения/исключения, параметров секвенирования и QC.
Если нужно, могу дать пример конкретного статистического рабочего протокола (скрипты/пакеты и команды) для реализации.