Кратко — клеточные и генетические причины мраморной (мозаичной) окраски и набор тестов, чтобы отличить вирус от хлоропластной мутации.
Возможные клеточные и генетические причины
- Мутации в геноме хлоропластов (точечные, делеции) → клетки с нефункциональными хлоропластами; гетероплазмия даёт секторность/мозаичность.
- Нуклеарные мутации в генах, кодирующих пласти́дные белки (биогенез хлоропластов, белки тилакоидов) → наследуемые по Менделю нарушения пигментации.
- Химерность (соматические клетки с разной генетикой: периклинальные/секторальные химерные ткани) → устойчивые сектора без системной передачи.
- Активность транспозонов/соматические мутации, дающие секторную пигментацию.
- Вирусная инфекция (системная или локальная) — вирусы нарушают синтез хлорофилла/структуру хлоропластов и дают мозаичность; часто сопровождается сосудистыми/карликовыми симптомами, может образовывать включения и вызывать межклеточный неконкордантный рисунок.
- (Дополнительно) физиологические дефициты или фитотоксичность дают похожую хлорозную мозаичность, но обычно менее чёткие сектора.
Какие наблюдения на клеточном уровне помогут ориентироваться
- Хлоропластная мутация: в поражённых клетках видны дефекты хлоропластной ультраструктуры (разрушенные тилакоиды) при TEM; сектора чётко ограничены, часто постоянны.
- Вирус: включения (цистерны/кристаллы), вирусные частицы при TEM; симптоматика часто распространяется по тканям; неконсистентность с материнским наследованием.
Эксперименты и ожидаемые результаты (быстро и по сути)
1) Гибридизация/скрещивание (наследование)
- Провести контрольные скрещивания и проанализировать потомство.
- Если признак наследуется по матери (только потомство от матери‑«бледной» даёт фенотип) → указывает на пластида‑наследование (хлоропластная мутация).
- Если признак следует Менделеву распределению (например, в простом случае рецессивный/доминантный — типично для нуклеарной мутации; в F2 могут наблюдаться соотношения вроде $3:1$) → нуклеарная мутация.
- Вирусы обычно не дают классической Менделевой передачи (инфекция передаётся не по генетике, хотя возможна семенная/популяционная передача редко).
2) Передача инфекции (физическая / биологическая)
- Механическая инокуляция/инфекция индикаторных растений или прививка (графт).
- Результат: если симптоматика передаётся через сок/графт → сильный признак вируса. Мутация не передаётся таким путём.
3) Молекулярные тесты на вирус
- ELISA/иммуноблот для капсидного белка, RT‑PCR (или PCR для ДНК‑вирусов) с праймерами к известным вирусам, секвенирование.
- Положительный результат → вирус.
- Высокая концентрация вирус‑специфичных siRNA (small RNA‑seq) также указывает на вирус.
4) Молекулярная диагностика хлоропластов/нуклеарных генов
- Секвенирование ДНК хлоропласта (rbcL, matK и др.) — обнаружение мутаций/делеций.
- Секвенирование/генетический анализ нуклеарных генов, известных для биогенеза хлоропластов.
- Наличие стабильной мутации в ДНК → генетическая причина.
5) Культура апикальной меристемы / термотерапия
- Меристемная культура часто удаляет вирусы (меристема может быть свободна от вируса) → регенерированные побеги очищены от вируса, симптомы исчезают.
- Хлоропластная/нуклеарная мутация сохранится при регенерации.
6) Микроскопия (световая, TEM) и биохимия
- TEM: обнаружение вирусных частиц или характерных включений → вирус. Деформированные/недоразвитые тилакоиды в хлоропластах → пластида‑дефект.
- Измерение хлорофилла, фотосинтетических параметров (Fv/Fm): изменения будут в обоих случаях, но не специфичны.
7) Локализация РНК/белков
- In situ гибридизация / иммунолабеллинг для вирусной РНК/капсида → локализация вируса в поражённых тканях.
- Отсутствие вирусных маркеров и наличие мутации в пластидном геноме → пластидная причина.
Краткая сводка «что делать первым»
- Выполнить RT‑PCR/ELISA для типичных вирусов культуры и попытаться механически передать на индикатор; одновременно сделать микроскопию/TEM.
- Если вирус отрицателен — провести секвенирование пластида/скрещивания и/или меристемную культуру для проверки стабильности фенотипа.
Эти наборы тестов обычно позволяют чётко отличить вирусную мозаичность (передаётся инфекционно, положительные молекулярные тесты, исключается при меристемной культуре) от хлоропластной или нуклеарной мутации (стабильная наследуемая мутация, выявляемая при секвенировании, материнское/Менделево наследование, сохраняется после регенерации).