Механизмы приобретённой резистентности (плазмид‑ассоциированные), кратко с пояснениями:
- Ферментативная инактивация антибиотика (плазмидные β‑лактамазы, аминогликозид‑модифицирующие ферменты) — разрушают или модифицируют препарат и делают его неактивным.
- Модификация мишени (метилазы рибосомы, плазмидные гены, защищающие ДНК‑гиразу типа qnr, плазмидные версии метилтрансфераз) — снижают аффинность антибиотика к своей мишени.
- Изменение проницаемости мембраны (потеря/мутирование поринов при одновременном наличи пласмидных механизмов) — уменьшает вход антибиотика.
- Эффлюкс‑насосы (плазмидные транспортеры) — выкачивают антибиотик из клетки.
- Замещение пути/биохимический обход (плазмидные резистентные изоформы ферментов, альтернативные элементы пути).
- Захват и распространение генов через мобильные элементы (интегроны, транспозоны, IS‑элементы на плазмидах) — обеспечивает быстрый горизонтальный перенос.
Экспериментальные подходы для идентификации генов резистентности (пошагово, с методами и обоснованием):
1. Подтвердить фенотип:
- Микробиологический тест чувствительности (MIC, диско‑диффузия) для определения профиля резистентности.
2. Выяснить плазмидную природу:
- Экстракция плазмидов и гель‑электрофорез (профилирование), S1‑PFGE для крупных плазмид.
- Проверка переносимости: конъюгация (фильтр‑mating) или трансформация в чувствительный лабораторный штамм → селекция на антибиотике; если переносится — резистентность плазмидная и конъюгативная.
- «Исцеление» плазмиды (curing) хим/темп‑методом — исчезновение фенотипа подтверждает роль плазмиды.
3. Молекулярная идентификация известных генов:
- PCR/реал‑время PCR для типичных генов (bla‑семейства, qnr, mcr, aac, erm, van и др.).
- Плазмидная типизация (Inc‑группы, pMLST) с использованием PlasmidFinder.
4. Последовательность и контекст:
- Секвенирование: гибридная сборка (короткие риды Illumina + длинные риды Nanopore/PacBio) для получения замкнутых контигов плазмид; аннотация с использованием баз CARD/ResFinder/NCBI.
- Определение структуры мобильных элементов (интегроны, транспозоны) и генетического контекста резистентных генов.
5. Функциональная валидация:
- Клонирование подозреваемого гена/контейнера в чувствительный штамм и проверка приобретённого фенотипа.
- Транспозон‑мутagenesis или CRISPR‑выключение для подтверждения роли гена.
- RT‑qPCR для оценки экспрессии гена; определение копийности плазмиды (qPCR) для связи дозы гена и уровня резистентности.
6. Эпидемиология/мониторинг:
- WGS‑анализ штаммов и плазмид для фило‑генетики и отслеживания распространения (SNP, MLST).
- Оценка частоты передачи в эксперименте (конъюгационные частоты).
Стратегии контроля распространения и обоснование (практические меры):
- Антибиотикостюардшип: назначать адекватный препарат по чувствительности, оптимальная доза и длительность, деэскалация по результатам — снижает селекционное давление, уменьшая шанс обогащения плазмидоносных штаммов.
- Таргетная терапия и комбинации при необходимости (чтобы подавить резистентные популяции и уменьшить вероятность выживания единичных плазмидоносных клеток).
- Инфекционный контроль в клинике: контактные меры, изоляция/кохортирование колонизированных пациентов, строгая гигиена рук, дефинированная уборка и дезинфекция поверхностей — прерывают передачу клеток и плазмидов между пациентами и персоналом.
- Скрининг и эпиднадзор: обследование контактных лиц/пациентов, молекулярный мониторинг (WGS, плазмид‑типирование) для раннего выявления вспышек и источников.
- Ограничение использования препаратов, стимулирующих передачу плазмидов (например, широкое применение препаратов, к которым имеется множественная резистентность) — уменьшает селекцию и распространение плазмидов.
- Контроль резервуаров вне пациента: обслуживание устройств, уход за ранами, управление сточными водами в стационаре — снижает экологическую циркуляцию плазмидов.
- Образование персонала и пациентов — улучшает соблюдение мер.
- В особых случаях (исследовательские/специфические подходы): лечение галогенирующими агентами/плазмид‑curing в лаборатории, разработка ингибиторов конъюгации или фаготерапия — перспективные, но не рутинные клинически.
Краткое обоснование: сочетание точной идентификации плазмидных генов (чтобы знать механизмы и пути передачи) и мер по снижению селекционного давления плюс разрыв путей передачи (инфекционный контроль) — наиболее эффективная стратегия остановить возврат инфекции и предотвратить локальную/больничную эпидемию.