Цель: создать трансгенное растение, которое устанавливает эффективную симбиозную ассоциацию с азотфиксирующими бактериями и получает от них фиксированный азот. Краткая стратегия, ключевые гены и главные биологические барьеры.
Краткая стратегия (поэтапно)
1. Выбор подхода: а) «создать у растения способность формировать бобообразные узлы (nodulation)» — переносить сигнальную и органогенетическую программу симбиоза; б) «сделать растение восприимчивым к эндофитным/ассоциативным фиксаторам» — обеспечить колонизацию и удержание бактерий в корне/эндосиме; в) гибридный — инженерные бактерии (стабильный nif‑комплекс, контроль O2) + растения, оптимизированные по приему/поддержке.
2. Восстановление и активация сигнально‑развивающего пути симбиоза (CSSP) в растении: обеспечить распознавание бактериальных сигналов, передачу кальциевых спайков и запуск транскрипционного комплекса для деления корковых клеток.
3. Обеспечение микросреды для работы нитрогеназы: формирование микроаэрофильной ниши (аналог узла) и синтез гемопротеина (леггемоглобин) для буферизации O2.
4. Метаболическая интеграция: транспортеры и ферменты для снабжения бактерий углеродом и для утилизации азота растением (синтез, перенос и хранение форм N).
5. Инженерия бактерий (если нужно): стабильная экспрессия nif/fix генов в эндосимбионте, регуляция по сигналам растения, O2‑защита нитрогеназы, зависимость бактерии от растения (биобезопасность).
6. Пошаговая валидация: сигнализация → колонизация → органогенез → активность нитрогеназы (ацетилен‑редукция) → прирост N в растении → урожай.
Ключевые растительные гены/модули для переноса/модуляции
- Сигнальные рецепторы и ранняя передача сигнала: LysM‑рецепторы (аналог NFR1/NFR5/LYK3) для распознавания LCO/Nod факторов.
- Общая симбиозная сигнальная система (CSSP): SYMRK (DMI2), CASTOR/POLLUX (ионные каналы), CCaMK (DMI3), CYCLOPS — для кальциево‑зависимой передачи и активации транскрипций.
- Транскрипционные регуляторы органогенеза: NIN, NSP1/NSP2, NF‑YA, ERN, RAM1 — для запуска кортикального деления и специализации клеток.
- Гормональная модуляция: рецепторы цитокинина (CRE1/LHK1), модификация локального уровня цитокинина/auxin для образования зародыша узла.
- Структурные/поддерживающие гены: ENOD‑гены (внезародышевые), факторы сосудистого развития (для транспорта продуктов и N).
- Оксигенация: леггемоглобин (Lb) или растительные аналоги для поддержания низкого свободного O2 в зоне фиксирования.
- Транспорт и метаболизм N/C: SUT/SWEET для экспорта сахарозы; инвертазы; AMT (аммониевый транспортер) для приёма аммония; GS/GOGAT для преобразования в аминокислоты; транспортеры для уреид/амидов (в зависимости от формы транспорта).
- Иммунная регуляция: локальная регуляция SA/JA/ET и PR‑ответов, модификация PRR/BAK1‑путей, чтобы не отвергать симбионта.
Ключевые бактериальные гены/модули
- Основные структурные и биосинтетические nif‑гены: nifH, nifD, nifK (нитрогеназный комплекс).
- Биогенез кофермента FeMo‑ко: nifB, nifE, nifN, nifV и вспомогательные (nifS, nifU) для сборки Fe‑S и FeMo‑ко.
- Регуляторы экспрессии: nifA/nifL (или fixLJ у симбиотических бактерий) — обеспечить включение nif в условиях растения.
- Компоненты защиты O2 и транспорта электронов: fixABCX, фередоксин (fdx), белки дыхательной цепи с высоким потреблением O2 (играют роль в поддержании микро‑окислительной среды).
- Металлотранспортеры: modABC (молибден), feo/feoB (железо), sul/поставка серы.
- Механизмы колонизации/эндофитизации: exo/pss для прикрепления, T3SS/T4SS модификация (или их подавление) для совместимости, синтез LCO/Nod‑подобных сигналов или EPS для укоренения.
- Биобезопасность: синтетические зависимости (auxotrophy), kill‑switch механизмы.
Ключевые биологические барьеры и пути их преодоления
1. Отсутствие распознавания и запуск программы узлообразования у не‑бобовых. Решение: перенос CSSP (LysM + SYMRK + CASTOR/POLLUX + CCaMK + CYCLOPS) и основных TF (NIN, NSP) либо заставить ассоциативный бактериальный штамм синтезировать LCOs, которые растение уже распознаёт.
2. Сложный органогенез (образование узла) — многогенетическая программа развития. Решение: поэтапный перенос ключевых регуляторов и контроль гормональной сети (цитокинин/auxin); ожидать много итераций и оптимизации выражения.
3. Хрупкость нитрогеназы к O2: ${\mathrm{N}}_2+8{\mathrm{H}}^{+}+8{\mathrm{e}}^{-}+16\mathrm{ATP}\to 2N{\mathrm{H}}_3+{\mathrm{H}}_2+16\mathrm{ADP}+16{\mathrm{P}}_{\mathrm{i}}$. Решение: создать микроаэрофильную нишу (аналог узла) + экспрессировать леггемоглобин в соответствующих клетках + бактерии с защитными системами (fix, high‑respiratory‑rate).
4. Высокая энергетическая стоимость: ~$16$ ATP на ${\mathrm{N}}_2$ (см. формулу выше) и большой поток углерода к симбионту. Решение: усилить сахарный экспорт (SWEET/SUT), усилить фотосинтез/доступ углерода, и регуляторно ограничить активность нитрогеназы по потребности растения.
5. Несогласованность регуляции и обмена (растение должно не подавлять фиксацию, бактерия — не «перетягивать» ресурсы). Решение: синтетическая регуляция nif под контролем растительных сигналов (сигналы O2, сахара, специфические фитосигналы).
6. Недостаточная биосинтезная аппаратура у бактерий/растения для коферментов (Mo, Fe, S). Решение: обеспечить путь транспорта и хранилища металлов; перенести/усилить соответствующие транспортеры и биосинтезные гены.
7. Иммунный ответ растения и экология/безопасность (распространение трансгенных бактерий). Решение: локальная иммунорегуляция в корне; инженерные ограничители распространения бактерий (auxotrophy, kill‑switch), оценка риска и нужные биоконтроли.
Практические замечания и приоритеты
- Начинать поэтапно: сначала добиться распознавания LCO и кальциевых спайков; затем индукции ранних ENOD‑генов и кортикального деления; далее — стабильная колонизация и формирование микросреды; в конце — полноценная нитрогеназа и обмен N.
- Чаще практикуемый путь сейчас — улучшение ассоциативных фиксаторов (инженерные Rhizobium/Herbaspirillum/Azospirillum) и модификация растения для лучшей колонизации (SWEETs, иммунная толерантность), т.к. полный перенос программы узлообразования в не‑бобовые технологически сложнее.
- Биобезопасность и регуляторные/экологические вопросы нужно прорабатывать на раннем этапе: конструкции ограниченной жизнеспособности бактерий, контейнмент экспериментов и оценка возможных эффектов на почвенную микробиоту.
Короткое резюме — приоритетные гены для трансфера/модуляции:
- в растении: LysM‑рецепторы, SYMRK, CASTOR/POLLUX, CCaMK, CYCLOPS, NIN, CRE1, Lb, SUT/SWEET, AMT, GS/GOGAT; иммуномодуляторы.
- в бактерии: nifHDK + nifEN(B) + nifS/U + fixABCX + fixLJ, modABC, фередоксин, колонизационные гены, механизмы O2‑защиты и биобезопасности.
Ожидаемые главные сложности: многогенетичность дикого фенотипа (нужны точные шаблоны пространственной и временной экспрессии), O2‑чувствительность нитрогеназы, энергетический налог, иммунная несовместимость и экологическая безопасность.