Коротко: сформулируйте конкретные гипотезы по механизму (что именно изменилось — cis‑регулятор, транскрипционный фактор, скорость транскрипции/трансляции, клеточный цикл, эпигенетическая компактизация хроматина, материнское вкладывание и т.п.), и для каждой предложите тесты, дающие различимые предсказания (генетика vs эпигенетика). Ниже — набор конкретных гипотез и планов проверки.
Гипотезы (с переменными):
- Изменён cis‑регулятор ключевого гена развития → изменена скорость транскрипции $k_{tx}$ или время начала экспрессии.
- Изменён уровень/активность транскрипционного фактора (trans) → косвенно меняет $k_{tx}$ у многих целей.
- Изменена стабильность мРНК/белка ( $k_{deg}$ или скорость трансляции $k_{tl}$ ) → меняется время достижения порогов.
- Изменена частота/длительность ранних клеточных циклов → изменение $T_{cc}$ удлиняет/сокращает эмбриогенез.
- Изменена эпигенетическая конфигурация (хроматин, метки гистонов, PcG/TrxG) → меняется доступность промоторов/энхансеров и динамика зиготического запуска.
- Материнский эффект (дефицит материнских РНК/белков) → изменение темпа независимо от генотипа зиготы.
Как проверять — эксперименты и ожидаемые результаты
1) Точная фенотипизация
- Измерьте временные точки (ядерные циклы, начало зиготической транскрипции, гаструляция, вылупление) живой микроскопией с маркерами (H2Av-GFP, membrane, nuclear marker).
- Сравните распределения времени между линиями/штаммами.
2) Cis vs trans (ключевые, быстрые тесты)
- Reporter assay: вставьте репортер под управлением модифицированного и WT регуляторного элемента в одинаковую «landing»‑точку (phiC31) в одной и той же генетической фоновой линии. Если различие остаётся → cis.
- Reciprocal crosses: скрещивайте модифицированный штамм с WT в обе стороны (модиф. мать × WT отец и WT мать × модиф. отец). Если фенотип следует за матерью → материнский/trans‑фактор; если фенотип определяется генотипом эмбриона → cis/trans zygotic.
- Allele‑specific expression: в гибридах измерьте уровни мРНК от каждой аллели (RNA‑seq с SNP) — cis проявляется как асимметрия выражения аллелей в одном ядре.
3) Генетический анализ
- Картирование и подтверждение: WGS/pooled mapping, дефицитная карта, CRISPR‑восстановление/ремонт регулятора. Восстановление WT последовательности должно вернуть фенотип при генетическом (мутационном) механизме.
- Комплементационные тесты и модификации транскрипционных факторов (RNAi / CRISPR KO / overexpression).
4) Эпигенетика, хроматин и время транскрипции
- ATAC‑seq/ChIP‑seq по стадиям эмбриогенеза для маркеров: H3K27ac, H3K4me3 (актив.), H3K27me3, H3K9me3 (репрессия), H3.3/H2A.Z (варианты). Сравните WT и модифицированный штамм на отдельных стадиях.
- Nascent RNA (PRO‑seq, GRO‑seq, EU‑labeling) или single‑embryo RNA‑seq по времени — выяснить сдвиг в запуске зиготической транскрипции.
- Если изменение эпигенетическое, ожидайте различия в профиле хроматин‑марок и доступности, часто без изменения последовательности ДНК; изменение может быть частично наследуемым в последующих поколениях.
5) Кинетика экспрессии и пороговая модель
- Измерьте $k_{tx}$, $k_{deg}$ и $k_{tl}$ (набор: qPCR с инhibition chase, 4sU‑labeling для скорости транскрипции, Ribo‑seq для трансляции). Модель: стадию достижение порога экспрессии можно аппроксимировать временем $t^{\ast }$, зависящим от $k_{tx}$ и $k_{deg}$; например steady‑state $m=\frac{k_{tx}}{k_{deg}}$, время выхода на порог ~ логарифмическая функция этих параметров.
- Если изменение времени при тех же $k_{tx}$ но изменён $k_{deg}$ или $k_{tl}$ → посттранскрипционная причина.
6) Тесты на материнский эффект и транслокацию факторов
- Knockdown материнских РНК/белков (maternal RNAi) или замена материнского генотипа (reciprocal cross) — если фенотип определяется материнской средой → материнский эффект.
- Микроинъекция мРНК/белка в оплодотворённые яйца для резкой инверсии фенотипа.
7) Фармакологические и эпигенетические вмешательства
- Ингибиторы HDAC (TSA), HMTases/HDMs, ингибиторы транскрипции (α‑amanitin) или протеасомные ингибиторы — проверяют чувствительность и восстановление темпа.
- Если фенотип модифицируется кратковременным ингибитором и эффект наследуется после удаления ингибитора → возможна эпигенетическая переустановка.
8) Транзитивность/наследуемость
- Бридинг: верните мутантный регулятор в WT фон через серию бэкоф‑скрещиваний; если фенотип остаётся при WT генотипе → эпигенетическая/наследуемая модификация.
- Если фенотип исчезает при замене последовательности регулятора на WT → генетическая причина.
9) Сопутствующие тесты (метаболизм, протеостаз, клеточный цикл)
- Измерьте ATP, дыхание митохондрий, размер/скорость роста клеток, маркеры клеточного цикла (phospho‑histone H3) — чтобы отличить «энергетический» или «клеточный цикл» эффект от чисто транскрипционного.
- Если изменение темпа коррелирует с изменением $T_{cc}$ → причина в регуляции деления/роста.
Критерии интерпретации (коротко)
- Cis: reporter в одинаковом фоне повторяет фенотип; allele‑specific bias в гибридах; восстановление последовательности убирает фенотип.
- Trans (генетика): одинаковый репортер в мутантном фоне меняет время; мутации в TF/rescue подтверждают.
- Материнский: фенотип следует за материнским генотипом в reciprocal cross.
- Эпигенетика: отличие в хроматин‑марках/ATAC без изменения ДНК; фенотип может передаваться через поколения при отсутствии изменения последовательности; чувствителен к ингибиторам хроматин‑модификаторов.
Рекомендуемая минимальная проверочная последовательность (практический план)
1) Точная временная фенотипизация (time‑lapse) + reciprocal crosses.
2) Reporter assays (WT vs модиф регулятор в одном landing site).
3) RNA‑seq time series + allele‑specific analysis.
4) ATAC/ChIP‑seq по ключевым маркерам на тех же стадиях.
5) CRISPR‑ремонт регулятора и/или изменение TF уровней для восстановления/реконституции фенотипа.
6) Наследуемость тест (backcrosses, отсутствие изменения последовательности).
Эти комбинации позволят отделить cis‑генетический эффект от trans‑генетического и от эпигенетической перерастройки хроматина; дальше — детальные функциональные тесты конкретных кандидатов (TF, хистонмодификаторы, факторы материнского вклада).