Кратко — молекулярные механизмы и проверочные эксперименты.
Молекулярные механизмы (почему наблюдаемое происходит)
- Деление клеток: микротрубочки формируют митотическое веретено, обеспечивают сборку бивалентов и натяжение кинетохор — при разрушении веретено не формируется → активация контрольной точки сборки веретена (SAC: Mad2, BubR1 и др.) → подавление активности APC/C → накопление циклина B и блок выхода из митоза (метафазный арест). Также возможны хромосомные ошибки и апоптоз.
- Полярность клеток: микротрубочки ориентируют центрирование МТОЦ/центросомы, Голджи и обеспечивают доставку полярных маркеров (PAR‑белки, аPKC, экзосомные/клиренсные везикулы). Разрушение MT приводит к потере ориентировки МТОЦ, рассредоточению Голджи и неверной доставке/локализации белков адгезии (E‑cadherin, ZO‑1) → утрата апико‑базальной полярности.
- Внутриклеточный транспорт: долгодистанционная транспортировка органелл/везикул выполняется моторными белками (кинесины к плюс‑концу, динеин к минус‑концу) по MT. Разрушение MT устраняет дорожки → уменьшение скоростей и дальности перемещений, накопление/кластеризация органелл (рассред­чение или фрагментация Голджи, скупчение или перераспределение митохондрий, лизосом и эндосом), нарушение эндоцитоза/рециркуляции мембранных белков.
Предложенные эксперименты для проверки гипотезы (метод — ожидаемый результат)
1) Верификация разрушения MT и смены полимера/мономера
- иммунофлуоресценция α‑тубулин (флуор.) и конфокальная микроскопия — потеря филаментов.
- биохимический седиментационный анализ: центрифугирование → Western blot α‑тубулин в пеллете (полимер) vs супернатанте (димер). Ожидается увеличение растворимого тубулина.
2) Блок митоза / активация SAC
- иммунофлуоресценция фосфо‑гистона H3 и счёт митотического индекса (DAPI/H3P) — накопление клеток в митозе (примерно с $5\%$ до $>30\%$ как иллюстрация).
- локализация Mad2/BubR1 на кинетохорах; уровни циклина B и активность APC/C (Western blot или in vitro APC/C‑ассей). Ожидается: Mad2 на кинетохорах, повышенный циклин B, сниженная APC/C‑активность.
- живое наблюдение (GFP‑тубулин + H2B‑mCherry) — остановка в метафазе, отсутствует конгресса хромосом.
3) Нарушение полярности
- иммунокраски PAR3, aPKC, E‑cadherin, ZO‑1, Golgi (GM130) и центросомы (γ‑tubulin) — смещение/рассеяние маркеров и Golgi.
- функциональный тест эпителия: измерение трансэпителиального сопротивления (TEER) — снижение; флуоресцентный восстановительный эксперимент (FRAP) для мембранных маркеров — замедленная рекрустация и рециркуляция.
4) Нарушение внутриклеточного транспорта
- живые съемки траекторий везикул/органелл: Rab5‑GFP (эндо‑везикулы), Rab11‑GFP (рециркуляция), митохондр. маркеры — подсчёт скоростей и run‑length via kymograph; ожидается уменьшение скорости и расстояния перемещений.
- лечение ингибиторами моторов (цилiобревин для динеина, кинезин‑ингибиторы) в качестве контроля: если фенотип усиливается/совпадает — подтверждение роли MT‑зависимых моторов.
5) Восстановление/резкость
- отмена препарата (washout) — восстановление MT и частичное восстановление деления/полярности/транспорта если эффект обратимый.
- «спасение» стабилизирующими агентами (низкие дозы таксола) или переэкспрессия MAP (MAP4, CLASP) — частичное восстановление фенотипа.
6) Дополнительные контролы и чтения
- сравнение с известными MT‑дестабилизаторами (нокодазол/колхицин) по дозе ($100\mathrm{nM}-10\mu \mathrm{M}$) и времени ($30\min -4\mathrm{h}$).
- TEM/электронная микроскопия для ультраструктуры веретена и органелл.
- оценка апоптоза (cleaved caspase‑3, Annexin V) при длительном воздействии.
Кратко по ожидаемым наблюдениям при экспериментах: потеря микротрубочек в IF и седиментации; метафазный арест + локализация SAC‑белков; рассредоточение Golgi и полярных маркеров; снижение дальности/скорости везикулярного транспорта; частичное восстановление после washout или стабилизации MT.
(Если нужно, могу предложить конкретные протоколы/концентрации и перечень антител для каждого анализа.)