Краткая схема эксперимента для оценки влияния наночастиц (НЧ) на целостность клеточной мембраны и функцию органелл in vitro.
1) Модели клеток (выбор в зависимости от ожидаемого пути воздействия)
- Эпителиальные монослои: Caco-2 (кишечный барьер), Calu-3/16HBE (респираторный эпителий) — для оценки трансэпителиальной проницаемости и TEER.
- Печёночные клетки: HepG2 или первичные гепатоциты — метаболическая детоксикация.
- Макрофагоподобные: THP-1 (дифференцированные) или RAW264.7 — фагоцитоз и воспаление.
- Нейрональные/глиальные линии: SH-SY5Y / primary neurons — невротоксичность.
- Контрольные фибробласты: NIH/3T3 или BJ — общая цитотоксичность.
Выбор: включите один трансформированный/легко культивируемый и одну первичную/целеориентированную линию.
2) Подготовка НЧ и контроля
- Характеризация: размер (DLS, TEM), ζ-потенциал, агрегация в среде, концентрация (масса, число частиц, поверхность).
- Дезагрегация/сонификация, стереильность и эндотоксин (LAL).
- Контролы: отрицательный (растворитель), положительный для лизиса (Triton X-100 или $0.1\%$ SDS), и «сырые» материалы (ионный аналог, если применимо).
3) Условия экспозиции
- Диапазон концентраций: от низких до высоких, например $0.1$–$100\mu \mathrm{g}/\mathrm{mL}$\, (скорректировать под массу/поверхность/число).
- Временные точки: ранние и поздние — $1$, $4$, $24$, $72$ часов; при необходимости хронические сроки (до $7$ дней).
- Репликаты: технических $\ge 3$ на условие, независимых экспериментов $n\ge 3$.
4) Оценка целостности плазматической мембраны
- LDH-реакция (измерение в супернатанте): учесть контроль интерференции НЧ; относить к положительному контролю (Triton). Критерий повреждения: LDH-релиз >$30\%$ от положительного контроля или статистически значимо выше плацебо.
- PI/7-AAD проницаемость (флоуцитометрия или микроскопия) — доля PI+ клеток. Критерий: PI+ >$10\%$ и/или значимое повышение относительно контроля.
- Calcein-AM / EthD-1 живые/мертвые (конфокальная или HCI) — подтверждение.
- Гемолиз (для взаимодействия с кровью): гемолиз >$5\%$ считается значимым.
5) Оценка функции органелл (мультиассайный подход)
- Митохондрии:
- Мitochondrial membrane potential: JC-1 (соотношение агрегат/мономер) или TMRE/TMRM; критический порог деполяризации: снижение >$30\%$.
- ATP: CellTiter-Glo; критический порог: падение >$20\%$.
- OCR/ECAR (Seahorse): базальное респирации, ATP-linked, максимальная, запасная ёмкость; значимые эффекты: уменьшение базального или запасного >$25\%$.
- ROS: DCFDA (цитозольный), MitoSOX (митохондриальный); считать значимым повышение ≥$2\times$ по сравнению с контролем.
- Лизосомы/эндосомы:
- LysoTracker, Acridine Orange (перераспределение), LysoSensor (pH) — изменение pH/резорбции. Критерий: значимая потеря сигнала/увеличение pH или релокация свободного красителя.
- CTSB/CTSD активация и мембранная проницаемость лизосом (анализ белков/ферментов).
- Автофагия/протеостаз:
- LC3-II / p62 (WB), GFP-LC3 puncta (микроскопия) — накопление/блокирование аутофагии.
- Эндоплазматический ретикулум:
- Маркеры ER-стресса: BiP/GRP78, CHOP (WB/qPCR).
- Кальциевая гомеостаза:
- Fluo-4 AM (цитозольный [Ca2+]) — острые изменения.
6) Визуализация и локализация НЧ
- Конфокальная живой-ячейки и HCI для колокализации НЧ с органеллами (маркерные красители/флуор. белки).
- TEM / STEM для подтверждения внутриклеточной локализации и повреждения мембран/органелл.
- CLEM (коррелирующая LM + EM) при необходимости.
- Суперразрешение (STED, SIM) при мелком распределении на мембране/органеллах.
7) Учет интерференций и контроль экспериментов
- Проверить взаимодействие НЧ с реагентами (например, поглощение/кварцевание света, каталитическое восстановление красителей). Для каждого теста включать «пробу» с НЧ + реагент без клеток.
- Использовать по крайней мере два ортогональных метода для ключевых выводов (например, LDH + PI + микроскопия).
- Нейтральные погодные условия, одинаковый тип среды и сыворотки, проверка агрегации в среде теста.
8) Количественная аналитика поглощения и дозиметрия
- ICP-MS / AAS или радио/флюоресцентная маркировка для количественной оценки внутренней нагрузки.
- Оценивать дозу не только по массе ($\mu \mathrm{g}/\mathrm{mL}$), но и по числу частиц и площади поверхности при возможности.
9) Статистика и критерии интерпретации
- Репликаты: технические $\ge 3$, независимые эксперименты $n\ge 3$.
- Тесты: нормальность → t-test/ANOVA с поправкой; при ненормальности — непараметрические тесты. P-value порог обычно $<0.05$.
- Практические критерии токсичности: снижение жизнеспособности (результат метаболических тестов) >$30\%$ по сравнению с контролем считать существенным/цитотоксичным.
- Мембранная потеря целостности: LDH >$30\%$ от положительного контроля или устойчивое увеличение PI+/7-AAD+.
- Органеллярные нарушения: сочетание нескольких показателей (напр., деполяризация ММП >$30\%$ + падение ATP >$20\%$ + снижение OCR >$25\%$) подтверждает митохондриальную дисфункцию. ROS ≥$2\times$ + лизосомальная дестабилизация → стресс-иницированное повреждение.
- Интерпретировать по паттернам: первичное повреждение мембраны (быстрые PI+/LDH) vs. первичное нарушение органелл (ранние изменения ММП/ATP/ROS перед потерей мембранной целостности).
10) Итоговый подход
- Многоуровневый дизайн: краткосрочные быстрые тесты мембраны + более детальные функциональные анализы органелл + морфология (EM) + количественная загрузка НЧ.
- Всегда подтверждать ключевые находки минимум двумя независимыми методами и учитывать возможные артефакты от НЧ.
Если нужно, могу предложить конкретную панель тестов и временную последовательность (протокол по часам) для одной выбранной клеточной линии.