Коротко и по существу — набор подходов и как читать результаты.
1) Предварительная информация (быстро, обязательна)
- Простая картина экспрессии: RT-qPCR / RNA-seq (взрослые/этапы развития), in situ / smFISH / иммуноокраска или GFP-репортер для пространственно-временной экспрессии.
Интерпретация: ткане- и временная экспрессия подсказывает где/когда ожидать фенотипы и какие процессы вероятны.
2) Генетические методы
- Удаление/инактивирование (CRISPR/Cas9 knockout, хомологичная рекомбинация): полноудаление или рамочные сдвиги. Сделать несколько независимых аллелей.
Интерпретация: сильный фенотип → ген необходим для этого процесса; эмбриональная летальность → критическая роль (делать условный/тканеспецифичный KO). Отсутствие фенотипа → дублирование/компенсация/условный эффект (см. ниже).
- Условный / тканеспецифичный KO (Cre-Lox, Gal4/UAS + RNAi): уточняет где/когда нужен ген.
Интерпретация: фенотип в конкретной ткани указывает на клеточный источник функции.
- Нокдаун (RNAi, morpholino) — быстрый, но контролирующиеся off-target эффекты; подтверждать генетическими аллелями.
- Перекрестные комбинации / эпистаз: генетические взаимодействия с известными компонентами пути (double mutants, suppressor/enhancer screens).
Интерпретация: подавление/усиление фенотипа указывает на положение в пути (upstream/downstream/parallel).
- Сверхэкспрессия / трансгенная экспрессия: тест на достаточность. Активирующие и доминантно-отрицательные варианты.
Интерпретация: фенотип при сверхэкспрессии → ген может быть достаточным для запуска процесса; доминантно-отрицательное указывает на сборку комплексов или конкуренцию.
3) Молекулярные и биохимические подходы
- Белковая локализация: GFP- или мCherry-фьюжн (эндогенное тегирование предпочтительно) + конфокальная/суперразрешение.
Интерпретация: локализация (ядро, мембрана, митохондрии, синапс и т.д.) сузит предполагаемую функцию.
- Взаимодействия: Co-IP / mass-spec, yeast two-hybrid, BiFC, proximity labeling (BioID, APEX).
Интерпретация: партнёры указывают на комплекс/путь; высокий процент белков из одного процесса → функциональная аннотация.
- Химическая активность: если предсказан фермент — провести in vitro assay с субстратами. Мутировать каталитический остаток (каталитически-мертвый мутант) и сравнить.
Интерпретация: подтверждённая активность доказывает молекулярную роль; отсутствие — возможно регулятор/структурный белок.
- ДНК/РНК-связывание: ChIP-seq / CUT&RUN (для фактора транскрипции), RIP/CLIP (для РНК-белков).
Интерпретация: мишени гена/белка, регуляторные сети.
- Транскриптомика/протеомика после удаления/пересильной экспрессии (RNA-seq, phospho-proteomics).
Интерпретация: набор изменённых генов/путей показывает downstream-эффекты и процессы, где ген действует.
4) Физиологические и фенотипические тесты
- Клеточная физиология: Ca2+-имиджинг, мембранная проводимость / patch-clamp, митохондриальная функция (OCR), секреция.
Интерпретация: изменение физиологических параметров напрямую связывает ген с конкретной клеточной функцией.
- Организмные фенотипы: рост, выживаемость, фертильность, развитие, поведение, стрессоустойчивость, метаболизм, иммунные ответы.
Интерпретация: фенотипы на уровне организма помогают связать молекулярную роль с биологическим смыслом.
- Визуализация клеточных процессов: динамическая микроскопия (миграция, митоз, аутофагия).
Интерпретация: наблюдаемые дефекты указывают на конкретные клеточные механизмы.
5) Контроли и проверка специфичности
- Восстановление фенотипа (rescue) эндогенным геном или трансгеном → подтверждает, что фенотип вызван потерей данного гена.
- Несколько независимых аллелей и эпититипы → уменьшают риск off-target/побочных эффектов.
- Использование каталитически-мертвых/дефектных мутантов для отличия структурной vs каталитической функции.
6) Как интерпретировать возможные варианты результатов (руководство)
- Появился однозначный фенотип при KO: ген необходим; проверить, можно ли восстановить резкием (rescue) — тогда прямое подтверждение. Анализ downstream-изменений даст механизм.
- Фенотип при сверхэкспрессии, но не при KO: ген, возможно, действует в ограниченном контексте или его сверхэкспрессия даёт нефизиологический эффект; требуется осторожность.
- Противоположные фенотипы при KO и overexpression: указывает на дозозависимую роль; проанализировать доминантные эффекты.
- Отсутствие фенотипа при KO: возможны функциональная редундантность (проверить паралоги), компенсация транскриптом/посттрансляционно, фенотип проявляется только при стресс/условиях (тестировать разные условия) или в специфичной ткани/времени (использовать условный KO). Делать сенситизированные фоны/экраны.
- Белок взаимодействует с известными компонентами пути: размещаем ген в этой сети; эпистаз определит порядок действия.
- Изменения в транскриптоме/протеоме: проводите корреляцию с обогащением путей (GO/KEGG) — указывает на процессы, которые регулирует ген.
- Биохимическая активность подтверждена: даёт конкретную молекулярную функцию — дальше проверять влияние на субстраты in vivo.
7) Практический рабочий план (рекомендованный порядок)
1. Профилирование экспрессии и локализации.
2. Создание KO/независимых аллелей + быстрый нокдаун.
3. Фенотипические и физиологические тесты на основе экспрессии.
4. Rescue и каталитические мутанты.
5. Interactome (Co-IP/MS, proximity labeling).
6. Omics (RNA-seq, протеомика) для поиска downstream-маркеров.
7. Эпистаз и генетические взаимодействия для размещения в пути.
Заключение (одно предложение): сочетание пространственно-временной карьеры экспрессии, подтверждённых loss/gain-of-function экспериментов, восстановления фенотипа, биохимического доказательства активности и анализа взаимодействий/диапазона downstream-эффектов даст надёжную функциональную аннотацию; отсутствие фенотипа требует проверки редундантности и/или стрессовых условий.