Коротко — возможные клеточно‑генетические механизмы и план экспериментов для их различения.
Возможные механизмы (с кратким пояснением)
- Мутация генома пластида (хлоропласта): седиментное гетероплазмное состояние (смесь нормальных и мутантных пластида) или фиксация мутантных пластида в клоне клеток → белые зоны лишены функциональных хлоропластов.
- Соматическая мутация ядерного гена, необходимого для биогенеза хлоропластов (рецессивная/доминирующая) в отдельных клеточных кломах → секторность.
- Химеризм по клеточным слоям меристемы (периклинальные/мериклинальные/секторные химеры): мутация локализована только в одном из слоёв (L1/L2/L3), что даёт характерную распределённость пятен.
- Транспозонная или структура генома‑мобильная активность (инсерции/эксцизии) → соматическая мозаичность экспрессии.
- Эпигенетическое выключение (метилирование, РНК‑силенсинг) ядерного гена, отвечающего за пигментацию, в отдельных клональных участках.
- Вирусная инфекция/патоген, вызывающий хлороз в очагах (нужно отличить от генетики).
Экспериментальный план (шаги + ожидаемые результаты, что различает механизмы)
1) Визуальная карты и анатомия
- Составить карту распределения белых/зелёных секторов по всему растению и по листу; проследить, сохраняются ли структуры при росте (сектор расширяется вдоль клональной линии).
- Микроскопия световая и эпидермальная: какое тканевое расположение белизны (только эпидермис, мезофилл и т. д.).
Интерпретация: если белое только в эпидермисе — подозрение на мутацию в L1; если весь мезофилл — L2/L3 или пластидная мутация.
2) Хлорофиллометрия и фотофизиология
- Измерить хлорофилл (экстракция 80% ацетоном): вычислить по А663 и А645:
$\text{Chl}a=12.7A_{663}-2.69A_{645}$,
$\text{Chl}b=22.9A_{645}-4.68A_{663}$.
- Измерить флуоресценцию PSII (Fv/Fm). Ожидаемо: зелёные секции $F_v/F_m\approx 0.75-0.83$, белые — сильно снижено ($<0.5$).
Интерпретация: если хлорофилл практически отсутствует и Fv/Fm низкое — дефект пластид/фоточувствительности.
3) Ультраструктура пластидов (TEM)
- Сравнить ультраструктуру пластид в белых и зелёных клетках. Белые: редуцированные/без тилакоидов (лейкопласты), зелёные: нормальные тилакоиды.
Интерпретация: отсутствие тилакоидов → повреждение/дефект пластидного генома или биогенеза.
4) Анализы ДНК пластида и гетероплазмия
- Выделить ДНК из зелёных и белых участков; амплификация и секвенирование ключевых генов пластида (например, psbA, rbcL) и сравнение на делеции/мутации.
- Квантитативный анализ мутант/дикий аллель: qPCR или ddPCR с аллель‑специфичными праймерами; вычислить отношение $R=\frac{N_{mut}}{N_{wt}}$.
Интерпретация: разница в составе пластида (высокая доля мутантных копий в белых участках) указывает на пластида‑основанную вариететность. Монотонная мутация пластидам (гомоплазмия) — сильный маркер.
5) Наследование (рекомбинация и размножение)
- Посев семян и/или опыты взаимных перекрёстных опылений (reciprocal crosses): исследовать потомство в зависимости от того, какой родитель был материнским.
Интерпретация: если признак передаётся строго по материнской линии (только потомки от поражённой матери имеют белые сектора) → пластида/цитоплазматическое наследование.
- Вегетативное размножение (черенки) из белых и зелёных зон: сохраняется ли фенотип?
Интерпретация: при ядерной мутации, взятый из белой зоны черенок обычно даст белые растения (если мутация в клеточных слоях меристемы, зависящая от исходной ткани); при гетероплазмии результат зависит от доли мутантных пластида.
6) Графтинг (прививка)
- Привить белую вершинку на зелёное растение и наоборот; наблюдать передачу признака.
Интерпретация: устойчивое распространение белизны через прививку редко при пластидах (обычно не передаётся), а системные вирусы или малые РНК могут распространяться.
7) Анализ ядерных генов и эпигенетики
- Секвенирование/амплификация кандидатов (гены биогенеза хлоропластов: например, GLK, POR, FtsZ и др.) из зелёных и белых участков; проверить на соматические мутации.
- Проверить экспрессию (RT‑qPCR) этих генов в белых и зелёных зонах.
- Проверить метилирование промоторов (бисульфит‑секвенирование) при подозрении на эпигенетическое выключение.
Интерпретация: соматическая ядерная мутация или эпигенетическое выключение даст различия в последовательности/уровне транскрипта.
8) Транспозоны / вирусы
- PCR/Southern для известных транспозонов в генах, секвенирование мест вхождения (если растение модельное или известны элементы).
- Тесты на вирусы (ELISA, RT‑PCR).
Интерпретация: обнаружение транспозона/вируса в белых зонах подтверждает соответствующий механизм.
9) Клональный анализ слоёв меристемы
- Микроскопическая картография потомков апикальной меристемы; при необходимости — лазерная микродиссекция и сравнение ДНК слоёв.
Интерпретация: распределение секторов по листу и растению позволит отнести мутацию к L1/L2/L3.
Схема принятия решений (коротко)
- Материнская передача (только из заражённой матери) + мутантная пластида в ДНК → пластида‑основанный механизм.
- Соматическая мутация в ядерном гене (различие последовательности/экспрессии) → ядерная мутация.
- Локализация только в эпидермисе (L1) → химера по слоям (ядерная мутация в L1).
- Обнаружение транспозона/вируса → соответствующая причина.
- Эпигенетические изменения в промоторах + восстановление фенотипа после деметилирования (напр., 5‑azaC) → эпигенетика.
Практические примечания
- Начните с простых тестов: карты секторов, хлорофилл/Fv/Fm, TEM, ДНК‑амплификация пластида, рекросс‑опыты. Эти шаги быстро исключают/подтверждают пластида vs ядерную природу.
- Для точной квантитации гетероплазмии используйте ddPCR; для слоёв меристемы — морфологический анализ и клонирование.
Если нужно — могу предложить конкретный список праймеров, протоколов ddPCR или пошаговый протокол для Arnon‑анализа (измерения хлорофиллов) для вашего вида растения.