Краткий ответ: при длительном затемнении соотношение «световая фаза : тёмновая (Кальвинов цикл)» смещается в сторону дефицита продуктов световой фазы (ATP, NADPH) и дезактивации ферментов тёмновой фазы; это снижает эффективную фиксацию углерода при последующем освещении. У светолюбивых и тенелюбивых растений эффекты различаются по скорости восстановления, по уязвимости к фотоповреждению и по запасам метаболитов — см. ниже механизмы и план эксперимента.
Возможные механизмы влияния
- Недостаток энергетических носителей: в темноте прекращается фотофосфорилирование → падают запасы ATP и NADPH, что ограничивает сразу восстановление и карбоксилирование после включения света.
- Дезактивация/деградация ферментов тёмновой фазы: Rubisco, Rubisco activase (RCA), SBPase и др. теряют активационное состояние и/или экспрессируются в меньшем количестве в темноте → медленная реставрация карбоксилирующей мощности.
- Потеря промежуточных метаболитов (RuBP, ТДФ): истощение пулов RuBP и трёхфосфатных соединений замедляет старт реакции карбоксилирования.
- Нарушение редокс-регуляции: система тиоредоксина/ферредоксин недозаряжена, неактивны редокс-зависимые ферменты Кальвина до восстановления в свете.
- Фотопротекция и фотоповреждение при резком включении света: если световые реакции восстанавливаются быстрее, чем тёмновая фаза, избыточные электроны приводят к генерации ROS и фотоинтенсивному повреждению PSII/PSI.
- Структурная перестройка хлоропластов: изменение размера антенн, количества PSII/PSI, мембранного организма – влияет на соотношение Jmax/Vcmax после длительной темноты.
- Изменения в транспорте и запасах углерода: мобилизация крахмала и сахаров в темноте, обратная связь на фотосинтез после света (sink/source balance).
Отличия светолюбивых (S) и тенелюбивых (T) растений
- S: обычно выше Vcmax и Jmax, быстрее фотохимическая индукция, большая способность к циклическому электронному потоку и NPQ → быстрее восстановление фотосинтетической мощности, но при резком высоком свете риск фотоповреждения меньше/больше в зависимости от адаптаций. Ожидается более быстрая реактивация Rubisco/RCA.
- T: меньшая Vcmax/Jmax, крупные антенны, меньшая емкость NPQ, более медленная индукция и восстановление ферментов → более медленная реставрация CO2‑фиксации и большая уязвимость к фотодампингу при внезапном высоком освещении.
(Ожидаемые следствия: при одинаковой длительности затемнения T покажут более сильное и длительное снижение эффективной фиксации углерода после восстановления света.)
Экспериментальный план для проверки гипотезы
1) Гипотезы
- H1: После длительной темноты скорость восстановления чистой фиксации CO2 (A) при освещении будет ниже у T, чем у S, из‑за медленной реактивации ферментов Кальвина.
- H2: При резком переходе к высокому свету после темноты T получат больший фотодефицит/повреждение PSII (пониженное Fv/Fm) чем S.
2) Материалы
- Выберите по одной‑двум видам: типичный светолюбивый (напр., Helianthus annuus) и тенелюбивый (напр., Hosta spp. или Ficus pumila).
- Репликация: $n=$ $6$ растений/вид/обработка.
3) Условия и обработки
- Контроль: непрерывный свет (интенсивность $I_c=$ $300\mu mol{m}^{-2}{s}^{-1}$ или видоспецифичный оптимум).
- Затемнение: длительности $24,72,168$ часов (каждая отдельно); затем одномоментное восстановление света.
- Два режима ре‑освещения: низкий свет $I_L=$ $100\mu mol{m}^{-2}{s}^{-1}$ и высокий свет $I_H=$ $1000\mu mol{m}^{-2}{s}^{-1}$ (чтобы проверить фотоповреждение при несоответствии).
4) Измерения (временная шкала)
- До затемнения (базовый), сразу после темноты (t=0), и при ре‑освещении: $t=$ $1,5,15,30,60,240$ минут и $24$ часа.
- Газообмен: нетто‑фотосинтез A, stomatal conductance g_s; A/Ci кривые для определения $V{c}_{max}$ и $J_{max}$.
- Хлорофилловая флуоресценция: $F_v/F_m$ (темновое), эффективная квантовая выходность Y(II), NPQ, оценка повреждения PSII.
- P700 (обмен для PSI) при возможности.
- Биохимия: активность Rubisco (активное состояние), содержание RCA (иммуноблот), содержание SBPase; уровни RuBP, 3‑PGA, сахаров, крахмала.
- АТФ/АДФ и NADPH/NADP+ соотношения (быстрые экстракции).
- Методы молекулярные: транскрипты rbcL/rca/sbpase (RT‑qPCR) для динамики экспрессии.
- Метаболиты стресса: ROS, MDA для окислительного повреждения.
- Морфометрия хлорофилла (a/b), содержание хлорофилла.
5) Анализ данных и критерии
- Калькуляция скорости восстановления: пусть $A_0$ — A сразу после темноты, $A_c$ — стационарный A в контроле. Тогда относительная доля восстановления в момент $t$:
$$R(t)=\frac{A(t)-A_0}{A_c-A_0}.$$ Определить время $t_{50}$ — время до $R(t)=0.5$.
- Сравнить $t_{50}$, максимальную A через $24$ ч, изменения $V{c}_{max}$ и $J_{max}$, $F_v/F_m$ между S и T для разных длительностей темноты и режимов света.
- Статистика: ANOVA с факторами вид, длительность темноты, интенсивность света; пост‑hoc тесты, корреляции между скоростью восстановления A и активностью Rubisco/RCA/пулом RuBP.
6) Ожидаемые результаты и интерпретация
- Если H1 верна: у T будет существенно больший $t_{50}$, более низкий восстановленный $V{c}_{max}$ и более медленная реактивация Rubisco по сравнению с S.
- Если H2 верна: при ре‑освещении $I_H$ у T снизится $F_v/F_m$ сильнее, возрастёт NPQ меньше или позднее, и возрастут ROS‑маркетры.
- Метаболические данные (RuBP, ATP/NADPH) позволят отличить лимит световой фазы от лимита тёмновой: быстрый рост NADPH/ATP при восстановлении, но низкий RuBP → лимит тёмновой фазы.
7) Дополнительные манипуляции (опционально)
- Применение ингибиторов/модификаторов: ингибирование RCA или восстановление RCA добавкой ATP‑похожих соединений in vitro, чтобы проверить роль RCA.
- Постепенное включение света (фотомодуляция) против резкого включения, чтобы оценить роль фотопротекции.
Кратко: измеряя динамику газообмена, флуоресценции, активности Rubisco/RCA и пулов метаболитов при различных длительностях темноты и режимах ре‑освещения, можно разграничить, насколько снижение эффективности фиксации обусловлено дефицитом световой фазы, дезактивацией тёмновых ферментов или фотоповреждением, и выявить различия между светолюбивыми и тенелюбивыми видами.