Коротко: причины снижения роста после введения плазмиды — биофизические/метаболические издержки плазмиды и побочные эффекты экспрессии генов плазмиды или её взаимодействия с хостом. Ниже — перечисление основных гипотез с кратким описанием и конкретными проверками (ожидаемый результат для подтверждения/опровержения).
1) Классическая нагрузка (replicative/replicon и экспрессионная стоимость)
- Механизм: репликация плазмиды, транскрипция и трансляция её генов «крадут» ресурсы (нуклеотиды, АТФ, рибосомы).
- Проверки:
- Сравнить кривые роста и удельные скорости роста $\mu =\frac{\ln N_t-\ln N_0}{t}$ между штаммом с плазмидой и без (несколько биологических повторов).
- Уменьшить копию плазмиды (перейти на низкокопийный ori) или понизить экспрессию промотором; если рост восстанавливается — подтверждение нагрузки.
- Калькуляция относительной фитнес-стоимости: $s=1-\frac{{\mu }_{\text{pl}}}{{\mu }_{\text{wt}}}$.
- Измерить нагрузку на трансляцию (полирибосомный профиль), падение уровня свободных рибосом — поддержка экспрессионной нагрузки.
2) Токсичность белка резистентности или побочных белков
- Механизм: белок резистентности (или соседние гены) токсичны/нарушают мембрану/метаболизм.
- Проверки:
- Сделать маркерную мутацию (рамочный сдвиг или стоп-кодон) в гене резистентности, оставив плазмиду — если рост восстанавливается, ген токсичен.
- Экспрессировать ген резистентности с контролируемым промотором (inducible): сравнить рост при индукции/без — токсичность зависит от уровня экспрессии.
- Измерить уровень белка (western blot) и локализацию; оценить мембранную целостность, проливки лактатдегидрогеназы, ROS-детекторы.
3) Высокая копия плазмиды (copy-number burden)
- Механизм: высокая PCN увеличивает нагрузку.
- Проверки:
- Измерить PCN qPCR: ${\text{PCN}}_{rel}=2^{-\Delta \Delta C_t}$ (плазмидный ген vs хромосомный контроль).
- Сравнить рост с плазмидой низкой/высокой copy‑number; корреляция PCN и снижения роста указывает на причину.
4) Регуляторные конфликты / транскрипционная интерференция
- Механизм: сильные промоторы плазмиды «перекрывают» хостовую транскрипцию, индуцируют стресс.
- Проверки:
- RNA-seq / RT-qPCR для ключевых стресс- и метаболических генов; наличие широкого изменения транскриптома — поддержка.
- Убрать/ослабить сильные промоторы на плазмиде и посмотреть на эффект.
5) Неправильная нагрузка белков на мембрану/секреция
- Механизм: белок резистентности вставляется в мембрану, нарушая её функции.
- Проверки:
- Оценка проницаемости мембраны, чувствительности к детергентам, окрашивание мембрано-чувствительными красителями.
- Мутация сигнального пептида/удаление TM‑домена — восстановление роста подтверждает.
6) Интеграция плазмиды в хромосому или рекомбинация
- Механизм: плазмида интегрировалась в важный ген хоста.
- Проверки:
- PCR/ответственный секвенирование границ; PFGE для хромосомного размера.
- Клонирование плазмиды в новый чистый хост: если фенотип не переносится — интеграция в первом штамме.
7) Активация стрессовых ответов / SOS / токсин-антитоксин («addiction»)
- Механизм: TA-системы или активация SOS тормозят рост.
- Проверки:
- Поиск генов TA или SOS-индикаторов в RNA-seq; создание плазмиды без TA-системы.
- Подавление антагониста антаитоксина — проверка на зависимость.
8) Побочные эффекты маркера селекции (например, прочие резистентные кассеты)
- Механизм: промоторы, антибиотицицидные элементы, маркеры транскрипционно активны.
- Проверки:
- Заменить/удалить маркер и сравнить рост.
9) Метаболическая нагрузка/изменение потребления субстратов
- Проверки:
- Замеры потребления глюкозы, выделения метаболитов (HPLC), измерение скорости дыхания (OCR).
- Дополнение среды (аминокислоты, предшественники) — если рост улучшается, дефицит ресурсов подтверждён.
10) Нестабильность плазмиды и частая потеря/сегрегация
- Механизм: плазмида вызывает перестройки/потери, требующие затрат на восстановление.
- Проверки:
- Оценка стабильности плазмиды без селекции (плотность носителей через колонии на селективном/неселективном агаре).
- Визуализация клеток с меткой GFP на плазмиде (flow cytometry).
Практический протокол проверки (порядок действий)
1. Получить контролируемые сравнения: штамм без плазмиды, с плазмидой WT, с плазмидой с инктивированным/rescue-геном; 3–5 биологических повторов.
2. Измерить рост (OD600), $\mu$, и провести конкурентные ассеи (смешанный рост; оценить $s$).
3. Измерить PCN (qPCR), экспрессию резистентного гена (RT-qPCR), белок (WB), transcriptome (RNA-seq) при необходимости.
4. Внести модификации: понижение копии, ослабление промотора, мутации в гене — смотреть восстановление роста.
5. Дополнительные специфические тесты (ROS, мембрана, метаболиты) на основании предварительных данных.
Ожидаемые результаты-интерпретация (коротко)
- Возврат роста при понижении экспрессии/PCN → нагрузка/экспрессионная токсичность.
- Возврат роста при инактивировании гена резистентности → токсичность конкретного белка.
- Изменённый транскриптом/метаболом без очевидной «одной причины» → глобальная регуляторная перестройка; нужны глубокие омные анализы.
Замечания по дизайну: всегда использовать биологические повторы, внутрисерийные и плазмидные контролы (пустая плазмида), и тестировать в нескольких условиях среды/штаммах, чтобы отделить общую нагрузку от специфических взаимодействий.