Проблема (коротко)
- Inclusion bodies (IB) — агрегаты перекошенных/нерастворимых рекомбинантных белков в бактериальной цитоплазме/перiplazме. Причины: высокая скорость синтеза, избыток гидрофобных/экспрессируемых доменов, нехватка шаперонов, отсутствие посттрансляционных модификаций (разрывы дисульфидных связей и т.д.), неподходящая среда (температура, состав среды).
Простая кинетическая модель (чтобы понять конкуренцию складывания vs агрегирования)
- Обозначим некорректно свернувшийся/незрелый белок как $U$, правильно свернувшийся — $F$, агрегат — $A$. Конкурирующие пути:
$$U\stackrel{k_f}{}F,U\stackrel{k_a}{}A.$$ Тогда
$$\frac{d[F]}{dt}=k_f[U],\frac{d[A]}{dt}=k_a[U].$$ - Общая экспрессия: $$P_{tot}=P_{sol}+P_{ins},f_{sol}=\frac{P_{sol}}{P_{tot}}.$$ - При чрезмерной скорости синтеза $r_p$ количество $U$ растёт, и если $k_a$ эффективнее $k_f$, растёт образование IB.
Стратегии для повышения выхода активного белка
1. Конструирование гена и оптимизация экспрессии
- Снижение скорости транскрипции/трансляции (сильность промотора, низкая концентрация индуцера) → уменьшение $[U]$.
- Оптимизация кодонов для хоста и добавление/удаление сигнал-пептидов.
- Модификации последовательности: мутации, уменьшающие гидрофобность, удаление предсказанных разворачивающихся регионов.
2. Температура и условия культивирования
- Понижение температуры индукции (например, с 37°C на $15-25$°C) замедляет синтез и повышает правильное складывание.
- Контроль pH, состава среды, добавление осмопротектантов/косолвентов (глицерин, бетаин) — повышают растворимость.
3. Хост и ко‑экспрессия вспомогательных белков
- Использование штаммов с улучшенной гелиопротеостазой (overexpressed GroEL/ES, DnaKJE), штаммов с окисляющей цитоплазмой (Origami) для дисульфидных белков.
- Ко‑экспрессия шаперонов, перераспределителей дисульфидных связей (DsbC, PDI) или изомеризующих ферментов.
4. Фьюжн‑теги и целенаправленные домены
- MBP, NusA, SUMO, GST — часто повышают растворимость; иногда требуется ферментативное удаление тега после очистки.
5. Транспорт/секреция
- Направление белка в перiplазму или секреция снижает агрегирование в цитоплазме и облегчает формирование дисульфидных мостов.
6. Инженерия процесса и контроль скорости
- Модуляция скорости роста, ROE (rate of expression) через промотор/индуктор, fed‑batch режимы, оптимизация времени индукции.
7. Восстановление из inclusion bodies (downstream)
- Силовая стратегия: выделение IB, сильное сольвентное растворение (мочевина, гуанидин) и последующая рефолдинг-диализация/разведение/он-колонный рефолдинг с контролем редокс‑системы.
- Мягкие режимы: селективная солюбилизация, использование детергентов/корректоров, высокого давления или хелатообразующих агентов.
- Колонные методы рефолдинга и оптимизация условий (концентрация белка при рефолдинге, буферы, редокс‑пары) важны для выхода активного белка.
8. Альтернативные подходы
- Клеточно‑свободные системы, eukaryotic hosts (Pichia, дрожжи, насекомые, клеточные линии) — часто дают более правильное складывание.
- Директная эволюция белка или селективные мутации для повышения стабильности/растворимости.
Мониторинг и метрики
- Оценка доли растворимого белка: SDS‑PAGE, вестерн, активностные тесты. Целевая метрика: $f_{sol}=\frac{P_{sol}}{P_{tot}}$.
- Анализ структуры IB (TEM, FTIR) и активности рефолдинга.
Ключевые компромиссы
- Снижение скорости экспрессии обычно повышает долю растворимого белка, но уменьшает общую продуктивность; рефолдинг позволяет получить много белка, но процесс трудоёмок и затратен. Практически сначала пробуют оптимизацию экспрессии/хоста/температуры/фьюжн-тегов, а при неуспехе — рефолдинг из IB.
Если нужно, могу кратко перечислить типичные комбинации мер для конкретных классов белков (малые цитозольные, многодоменные, с дисульфидами).