Кратко — как и почему изменение последовательности промотора меняет уровень транскрипции, и какие методы позволяют это количественно оценить.
Почему последовательность влияет на транскрипцию (механизмы)
- Мотивы и сайты связывания: изменение нуклеотидов меняет присоединение факторов транскрипции (TF) и РНК-полимеразы; приводит к изменению частоты инициирования.
- Ядро промотора (TATA, Inr, BRE, DPE и т.п.): мутации в этих мотивах изменяют вероятность формирования прекомплекса и перехода к элонгации.
- Расстояние/фаза между мотивами: сдвиги по рамке меняют кооперацию факторов.
- Хроматиновая организация: последовательность влияет на позиционирование нуклеосом и доступность ДНК.
- ДНК‑форма и энергетика: гибкость/кривизна и энергетика развёртывания промотора влияют на вероятность образования открытого комплекса.
- Последовательность может также менять сайты паузирования, скорость отбегания и стабильность транскрипта (косвенно).
Качественный итог: изменение последовательности меняет скорости основных шагов транскрипции — связывание (k_bind), инициация (k_init), уход в элонгацию (k_escape) и частоту/размер транскрипционных бурстов — что приводит к изменению среднего уровня РНК/protein.
Простая количественная формула (пример модели связывания)
- Вероятность связывания РНАП: $$P_{\text{RNAP}}=\frac{e^{-\beta \Delta G}}{1+e^{-\beta \Delta G}}$$ - Средний уровень РНК в простой стационарной модели: $$⟨m⟩=\frac{k_{\text{transcription}}\cdot P_{\text{active}}}{\gamma }$$ (где $\Delta G$ — свободная энергия связывания, $\beta =1/(k_{B}T)$, $k_{\text{transcription}}$ — скорость синтеза при активном промоторе, $\gamma$ — скорость деградации мРНК).
Для бурстовой модели: $$⟨m⟩=\frac{k_{\text{on}}}{k_{\text{off}}}\cdot \frac{k_{\text{syn}}}{\gamma }$$ (изменения последовательности могут менять $k_{\text{on}},k_{\text{off}},k_{\text{syn}}$).
Экспериментальные подходы для количественной оценки вклада элементов
1. Репортерные генные системы (люцифераза, GFP)
- Прямая оценка активности промотора по уровню сигнала; часто используется серия мутантов (site-directed или насыщенная мутагенеза).
- Метрика: относительная активность (fold change) или абсолютная (если калибровано).
- Хорошо для быстрого скрининга; требует контроля за трансфекцией/экспрессией (нормализация).
2. Массовые параллельные репортерные ассайи (MPRA, Sort-seq)
- Библиотеки тысяч вариантов промотора/мотивов в одной пробе; измеряется количество репортерной РНК на вариант (NGS).
- Позволяет измерить вклад каждой позиции (saturation mutagenesis) и строить модели зависимостей.
- Выход: счётчики RNA/DNA → относительная активность каждого варианта.
3. in vitro транскрипционные ассайи (run‑off, single‑round)
- Изолированная система с чистой РНАП и факторами; измеряет скорости и выход транскриптов при заданной последовательности.
- Даёт чистую оценку влияния последовательности на k_init и k_escape без хроматина.
4. ChIP-qPCR / ChIP-seq (RNAP II, факторы)
- Измеряет занятость промотора белками; количественно (occupancy) и по локусу.
- Комбинируется с мутациями для оценки влияния на связывание факторов.
5. Насинящие транскриптомные методы (GRO-seq, PRO-seq, NET-seq)
- Измеряют скорость синтеза и профилирование активной РНАП; дают данные о начале, паузах и скорости элонгации.
- Используются для оценки реального изменения инициирования и паузирования.
6. RNA-seq / RT-qPCR
- Измеряет уровни зрелой мРНК (steady-state); полезно совместно с измерением изменения стабильности РНК.
- Для оценки вклада промотора требуются контролирующие эксперименты, чтобы отделить транскрипцию от деградации.
7. Одномолекулярная визуализация в живых клетках (MS2/MCP)
- Наблюдение бурстов транскрипции в реальном времени; измеряет частоту бурстов, их продолжительность и размер → прямой разбор, какие параметры меняются при мутациях.
- Выход — временные ряды и статистика бурстов.
8. Биофизические/биохимические методы связывания (EMSA, SPR, DNase footprinting, HiTS-FLIP)
- Измеряют Kd и кинетику связывания TF/РНАП к конкретным последовательностям.
Как количественно выделить вклад конкретного элемента (подходы)
- Сравнительные мутации: замена/удаление элемента и измерение Δактивности (fold change, Δk).
- Насыщенная мутагенеза + MPRA: позиционно-специфическая чувствительность и эпистатические эффекты.
- Комбинированные измерения occupancy (ChIP/SPR) + output (MPRA, RNA-seq) → связывать изменение занятости с изменением транскрипции.
- Модельная подгонка: термодинамические/статистические модели или регрессия (линейная, GLM, ML) для аппроксимации вклада каждой позиции/мотивa; оценка параметров (например, ΔΔG от счёта PWM).
- Single‑molecule + статистический анализ бурстов для разбиения эффекта на изменение $k_{\text{on}},k_{\text{off}},k_{\text{syn}}$.
Практические замечания по экспериментам
- Нужна нормализация (контроль транфекции, библиотечные счётчики для MPRA).
- Учитывать влияние хроматина и контекста (in vitro ≠ in vivo).
- Репликация и статистическая оценка эффектов; учитывать эпистаз при множественных мутациях.
Короткая инструкция для постановки количественного эксперимента
1. Сформируйте набор вариантов (целевые мутации, насыщенная библиотека).
2. Выберите измерение: MPRA для масштаба, in vitro для механики, MS2/PRO-seq для динамики.
3. Измерьте occupancy (ChIP/SPR) и output (RNA/репортер) параллельно.
4. Подгоните модель (термодинамическая или регрессионная) для оценки вклада каждого элемента (например, оценка ΔG или изменение k).
Если нужно, могу привести пример дизайна MPRA‑эксперимента с ожидаемыми вычислениями и моделью для извлечения вкладов.