Кратко: основные этапы, которые могли нарушиться, — от распознавания сигнала при трансляции до везикулярного трафика и сортировочных сигнальных мотивов. Ниже — по пунктам: что могло пойти не так, как это проверить и как исправить.
Этапы (каждый пункт: проблема → тесты → исправление)
$1$ Ко-трансляционная адресация (сигнальный пептид / SRP → ER)
- Проблема: отсутствует/неактивен сигнал-пептид или сигнальная якорь‑последовательность, SRP не узнаёт, белок остаётся в цитозоле.
- Тесты: наличие N‑терминального сигнала по последовательности; фракционирование (цитозоль/мембрана) + WB; связывание с SRP (co-IP); полисомальная нагрузка/микросомы; защита протеазой в присутствии/отсутствии микросом (protease protection).
- Исправление: вернуть/вставить функциональный signal peptide или signal-anchor; переместить метку (GFP/His) так, чтобы она не закрывала сигнал; использовать известный эффективный сигнал (например signal peptide из BiP).
$2$ Проникновение через транслокон (Sec61) и интеграция в мембрану
- Проблема: не вставлен в Sec61, не интегрирован в липидный бислой.
- Тесты: crosslink к Sec61; protease protection и карбона́тная экстракция ($0.1$ M Na2CO3) — интегральные остаются в мембране; полярность топологии с N‑glycosylation‑репортерами.
- Исправление: изменить гидрофобность/длину TM‑домена, использовать проверенный TM-сегмент, снизить скорость экспрессии (уменьшить промотор/температуру) или коэкспрессировать компоненты транслокона/помощники.
$3$ Топология (ориентация доменов и правило «positive‑inside»)
- Проблема: инвертированная топология мешает локализации/функции.
- Тесты: N‑glycosylation site‑reporter (если сайт в люминальной стороне — гликозилируется); протеазная защита; янки с доступными эпитопами на поверхности.
- Исправление: изменить распределение положительных остатков (правило «positive‑inside»), переставить короткие заряженные участки, изменить положение сигнального якоря.
$4$ Свойства TM‑домена (гидрофобность, длина, заряды)
- Проблема: TM слишком короткий/нехидрофобный для плазматической мембраны (плазма требует длиннее), или слишком гидрофобный вызывает агрегирование.
- Тесты: анализ гидрофобности TM; замеры локализации в разных мембранах; мутанты с заменой TM.
- Исправление: удлинить/корректировать гидрофобность TM (замена на TM из белка с желаемой локализацией), добавить/убрать заряды у краёв TM.
$5$ Свёртывание, шапероны, ER‑удержание и ERAD
- Проблема: неправильная свёртка → удержание в ER или деградация.
- Тесты: ко‑иммунопреципитация с BiP/Calnexin; вертикальный WB с ингибитором протеасомы (MG132) — накопление пре‑форм; анализ гликозилирования (Endo H чувствительность).
- Исправление: снижать скорость синтеза, ко‑экспрессировать шапероны, вводить мутации, облегчающие свёртывание, изменить температуру экспрессии; устранить последовательности, вызывающие агрегирование.
$6$ Гликозилирование и модификации, необходимые для выхода из ER
- Проблема: отсутствие N‑гликозилирования/о‑/пальмитоилрования мешает экспорту.
- Тесты: Endo H vs PNGase F (чувствительность указывают на нахождение в ER или прохождение через Golgi); масс‑спектрометрия для липидных модификаций.
- Исправление: ввести/переместить консенсус‑сайты N‑гликозилирования; обеспечить доступность нужных остатков; обеспечить клеточную систему, умеющую делать модификацию.
$7$ ER → Golgi экспорт (COPII, экспортные сигналы)
- Проблема: нет ER‑экспортных сигналов (ди‑кислотные, ди‑лусины, фуриновая обработка и т.п.) — белок задерживается в ER.
- Тесты: co‑localization с ER (calnexin) и Golgi (GM130); pulse‑chase + Endo H; мутирование известных сигналов.
- Исправление: добавить/восстановить ER‑export motif (например ди‑аспартат/ди‑глу), или переносить в мембранный белок‑носитель с хорошим экспортом.
$8$ Golgi‑сортировка и конечная доставка (апартаменты признаков для PM/органелл)
- Проблема: отсутствуют сигналы для плазматической мембраны или есть сигналы ориентирования в мембрану органелл.
- Тесты: surface‑biotinylation; trypsin‑доступность на живых клетках; ко‑локализация с маркерами конечной локализации.
- Исправление: добавить сигналы для PM (положительные/длинный TM), удалить эндосомные/лазерные сигналы, добавить GPI‑якорь при необходимости.
$9$ Интерференция тегов/конструктов
- Проблема: N‑ или C‑terminal теги блокируют сигнал/топологию.
- Тесты: сравнить локализацию с/без тега, или с тегом на другом конце; вставить короткий гибкий линкер.
- Исправление: переместить/удалить тег, использовать внутренний тег, маленький эпитоп (HA, FLAG) или клейкий линкер.
$10$ Перегрузка системы и выбор экспрессирующей системы
- Проблема: чрезмерная экспрессия засоряет транслационно‑транспортные пути; неродная система не обеспечивает нужных компонентов.
- Тесты: снизить уровень экспрессии, менять систему (бактерии/фруктовый дрожжевой/инсект/млекопитающие) и смотреть на локализацию.
- Исправление: уменьшить промотор/индуктор; сменить клеточную линию или использовать in vitro транслокацию с микросомами; ко‑экспрессировать вспомогательные белки.
Практическая диагностическая последовательность (рекомендуемый рабочий план)
- 1) Микроскопия (конфокальная) + маркеры ER/Golgi/PM — быстрый взгляд на задержку.
- 2) Фракционирование мембрана/цитозоль + WB; surface‑biotinylation/trypsin.
- 3) Endo H vs PNGase F и protease protection → ER vs проследование и топология.
- 4) Карбона́тная экстракция для проверки интегральности.
- 5) Co‑IP с BiP/Sec61, pulse‑chase для кинетики; тесты с модификациями.
- 6) Мутирование/перестройка конструкта на основании результатов (добавить сигнал, поменять TM, убрать тег и т.д.).
Коротко о практических хитростях
- Для PM обычно TM длина $\sim 20\text{-}25$ аминокислот и более гидрофобный; ER‑TM могут быть короче. Учитывайте правило «positive‑inside». Теги лучше ставить после сигнального пептида или с гибким линкером. При сомнениях поменяйте TM на известный «работающий» из белка, локализующегося в нужной мембране, и сравните.
Если нужно — могу предложить конкретный экспериментальный план для вашего конструкта (какие мутанты сделать, какие мутации/сигналы вставить и точные тесты).