Возможные внутриклеточные причины замедления деления дрожжей и как их различить экспериментально.
1) Активация контрольных точек ДНК/репликации (Mec1/Tel1 → Rad53/Chk1)
- Суть: повреждение ДНК или репликационный стресс тормозят переход S→G2/M.
- Тесты и ожидаемое: фосфорилирование Rad53 (WB), фосфо‑H2A (γH2A) ↑, RPA/γH2A‑фокусы в микроскопе; торможение включения метки репликации (EdU) и накопление клеток с содержанием ДНК $1C-2C$ (переход S). Удаление/подавление checkpoint‑генов (rad9, rad53, mec1) снимает блок.
2) Репликационный дефицит (недостаток dNTP, полимеразные дефекты)
- Суть: снижение скорости синтеза ДНК → замедление S‑фазы.
- Тесты: EdU/BrdU‑включение ↓, RPA‑фокусы, Rad53 фосфорилирование. dNTP‑пулы измеряются HPLC/LC‑MS; добавление нуклеотидов или overexpression RNR восстанавливает S‑ход.
3) Нарушение TORC1/PKA‑сигналинга (мискорегуляция питательных сигналов)
- Суть: неправильная «чувствительность» к питанию даёт G1‑задержку, снижение биосинтеза рибосом и трансляции.
- Тесты: уменьшенная фосфорилизация Sch9/Rps6 (WB), снижение глобальной трансляции (полисомный профиль, ^35S‑метионин), повышение аутофагии (Atg8‑PE, GFP‑Atg8), фенокопия с rapamycin. Активация PKA/Sch9 (Ras2G19V, Sch9‑active) частично восстанавливает рост.
4) Дисфункция цилин‑CDK системы (падение циклинов или стабилизация ингибитора Sic1)
- Суть: недостаточная CDK‑активность тормозит переходы G1→S или G2→M.
- Тесты: уровни Cln1/2, Clb5/6, Sic1 (WB); CDK‑киназный тест (например, гистон H1 фосфорилирование). Overexpression CLN2/CLB5 или делеция SIC1 восстанавливает деление при специфической причине.
5) Активация шпиндельной контрольной точки / митотическая блокада
- Суть: дефекты крепления хромосом → метафазная задержка.
- Тесты: клетки с $2C$ ДНК, короткие шпиндели на микроскопии (tubulin‑GFP), стабилизация Pds1/securin, зависимость от Mad2. Удаление mad2 снимает блок.
6) Проблемы цитокинеза / септины / клеточная стенка
- Суть: ядро делится, но цитокинез/септинный кольцо не работают → замедленный размножение, аномальная морфология.
- Тесты: Myo1/Septin‑флуорофоры, каликофлуорное окрашивание (chitin), цепочки/мультиядровые клетки в микроскопе; Slt2/Mpk1 фосфорилирование при нарушении целостности стенки.
7) Нарушение рибосомогенеза / трансляции
- Суть: снижение синтеза белка удлиняет цикл (особенно G1).
- Тесты: снижение пре‑rRNA уровней (Northern/qPCR), полисомный профиль «сдвиг в моносомы», уменьшение ^35S‑инкорпорации; мутации/ингибиторы рибосом дают схожий фенотип.
8) Митохондриальные дефекты / низкий ATP / окислительный стресс
- Суть: энергетический дефицит или ROS активируют стресс‑пути и тормозят цикл.
- Тесты: ATP‑люциферазный тест ↓, Δψ (JC‑1), O2‑потребление; ROS‑красители (DHE/DCF); рост нарушение на неперевариваемых субстратах (глицерол). Антиоксиданты или восстановление дыхания частично восстанавливают деление.
9) Протеасомная дисфункция / накопление убиквитинированных белков
- Суть: нарушение деградации циклинов/регуляторов → сбой цикл‑прогрессии.
- Тесты: накопление убиквитинированных белков (WB), снижение активности протеасомы; фенокопия с MG132 (с учётом проницаемости).
Практическая диагностическая последовательность (кратко)
1) Описать фенотип: скорость роста, индексы почкования (budding index), морфология (микроскопия).
2) DNA‑контент по FACS (ожидаемые скопления в G1 $1C$, S‑фаза, G2/M $2C$).
3) На основе точки остановки выбрать панели: checkpoint (Rad53, γH2A), циклины/Sic1, шпиндель (tubulin, Pds1/Mad2), TOR/PKA (p‑Sch9/p‑Rps6, полисомы), трансляция (35S, полисомы), митохондрии (ATP, O2), ROS, UPR (HAC1 сплайсинг).
4) Рескю‑тесты: overexpression ключевых генов (CLN2, RNR, SCH9active), антиоксиданты, добавление dNTP/компонентов, удаление checkpoint‑генов — чтобы подтвердить причинность.
Эти комбинации позволяют быстро отделить сигналинговые дефекты (TOR/PKA), контрольные точки ДНК/репликации, дефекты трансляции/рибосомогенеза и механические проблемы митоза/цитокинеза.