Коротко — что ожидается и как проверить.
Влияние мутации в энхансере
- Может изменить уровень экспрессии целевых генов: усиление или ослабление транскрипции в зависимости от утраты/появления сайтов для факторов транскрипции, изменения активности хроматина или перестройки взаимодействий с промоторами.
- Эффект может быть многогенным (энхансер контактирует с несколькими промоторами) и клеточно‑/временнo‑специфическим.
- Возможны аллель‑специфичные эффекты, компенсация другими регуляторными элементами или эффект «побочного захвата» (enhancer hijacking).
Стратегия подтверждения (предсказание → редактирование → анализ). Коротко по шагам:
1) Биокомпьютерные предсказания
- Поиск TF‑мотивов (HOMER, FIMO), консервативность, eQTL/GWAS‑колокация, базы: ENCODE/FANTOM/GeneHancer.
- Предположить целевые гены по данным Hi-C/Promoter Capture или по ближайшим контактам.
2) Точная геномная модификация
- Для точечной мутации: CRISPR‑base editors или prime editor (без двусцепочечных разрывов).
- Для удаления/блокировки: CRISPR/Cas9‑deletion (двух sgRNA) или CRISPRi (dCas9‑KRAB) для временной репрессии.
- Сделать изогенные клоны: мутант и контроль (wild‑type) для исключения фоновых вариаций; по возможности восстановление (rescue).
3) Анализы экспрессии
- RNA‑seq (bulk) для выявления дифферентно экспрессированных генов; значимая смена: $|{\log }_2\mathrm{FC}|>1$ и $p<0.05$ (FDR скорректированный).
- Allele‑specific RNA‑seq, если доступна гетерозиготность, для прямой оценки аллельной активности.
- qRT‑PCR для валидации ключевых генов; Western blot / протеомика при необходимости.
4) Хроматиновая и связывающая оценка
- ATAC‑seq для изменения доступности хроматина.
- ChIP‑seq для маркеров активных энхансеров (H3K27ac), и для соответствующих TF.
- CUT&RUN/CUT&Tag как альтернативы с меньшим вводом клеток.
5) Пространственные контакты
- 3C/4C для одного промотора или Capture‑C/HiChIP/PLAC‑seq/Hi‑C для глобальной карты взаимодействий; сравнить контакты WT vs мутант, чтобы увидеть изменение связи энхансер→промотор(ы).
6) Функциональные клеточные/тканевые тесты
- Репортер‑ассай (luciferase или MPRA/STARR‑seq) с WT и мутантной последовательностью в релевантной клеточной линии — измеряет прямую активность. MPRA позволяет тестировать множество вариантов одновременно.
- Perturb‑seq (CRISPR perturbation + scRNA‑seq) для оценки эффекта на транскриптом на уровне отдельных клеток и выявления клеточно‑специфичных ответов.
7) Контроли и репликация
- Несколько независимых клонов, комплементарные эксперименты (удаление vs rescue), отрицательные и позитивные контроли.
- Проверка off‑target эффектов редакторов (GUIDE‑seq/amplicon‑seq).
Интерпретация результатов
- Если при мутации снижается активность энхансера и падает транскрипция нескольких генов, плюс уменьшаются контакты и H3K27ac — прямая регуляция вероятна.
- Несогласованные данные (например, изменение активности без изменения экспрессии) указывают на контекст‑ или компенсаторные механизмы.
Короткий список ключевых методов для применения: CRISPR‑base/prime editors, CRISPRi/a, RNA‑seq (+allele‑specific), ATAC‑seq, ChIP‑seq (H3K27ac, TF), Hi‑C/4C/Capture‑C/HiChIP, репортеры (luciferase/MPRA), pertub‑seq.