Кратко: метилирование ДНК и модификации гистонов задают доступность хроматина и привлечённость транскрипционных факторов, что переключает программы генных экспрессий и тем самым направляет или блокирует дифференцировку. Для доказательства причинно‑следственной связи нужны направленные (gain/loss) вмешательства в эпигеном в сочетании с измерением транскриптома и функциональных исходов, плюс обратимость/резолютивные эксперименты.
Механизмы (сжато)
- ДНК‑метилирование (CpG): промотор/энхансерное метилирование обычно репрессирует экспрессию; деметилирование (TET‑опосредованное 5hmC → 5fC → 5caC → восстановление) способствует активации генов линейного программирования.
- Модификации гистонов: H3K4me3 — активные промоторы; H3K27me3 (Polycomb) — репрессия; H3K27ac — активные энхансеры; H3K9me3 — плотная конденсация/репрессия. Бивалентность (H3K4me3+H3K27me3) у генов развития поддерживает «готовность» к дифференцировке.
- Последствие: изменение метил/ацетил статусов меняет доступность ДНК, связывание TF и полимеразы, что переводит клетки в иные траектории дифференцировки.
Эксперименты, подтверждающие причинно‑следственную связь (концептуально)
1. Генетические потери/приобретения функции (высокоуровнево)
- Knockout/knockdown DNMTs (например DNMT3A/B) или TETs; наблюдать влияние на деметилирование, профиль экспрессии и способность к дифференцировке. Обратный подход — сверхэкспрессия.
- Аналогично для энзимов модификаций гистонов (EZH2, KDM6A/B, p300, HDACs).
(Ожидание причинности: направленное изменение энзимной активности → изменение эпигенетики → изменение экспрессии → изменение дифференцировочного фенотипа.)
2. Целевая эпигеномная редакция локуса (strong causal test, без изменения пула генов)
- Локус‑специфические эффекты: dCas9‑фьюжны (dCas9‑TET1, dCas9‑DNMT3A, dCas9‑p300, dCas9‑KRAB, дема/метилаза) направляют деметилирование/метилирование или ацетилирование/деацетилирование конкретного промотора/энхансера. Если манипуляция влечёт изменение экспрессии целевого гена и переводит стволовую клетку в конкретную линию — это сильный аргумент за причинность.
- Контроль: ферментально неактивные фьюжны и негейтированные участки.
3. Фармакологические вмешательства (высокоуровнево)
- Ингибиторы DNMT (неспецифические) или HDAC/блокаторы KDM/EZH модификаторов, в сочетании с омникс‑аналитикой; полезно как вспомогательный, но неспецифичный тест. Нужны orthogonal подходы для подтверждения специфики.
4. Временная сериальная (time‑course) корреляция и последовательность событий
- Высокочастотный time‑course (эпигеном → транскрипт → фенотип) показывает, что эпигенетическая смена предшествует изменению экспрессии и дифференцировке: $\text{вмешательство}\Rightarrow \text{эпигенетическая смена}\Rightarrow \text{изменение транскрипта}\Rightarrow \text{функция}$.
5. Одноклеточные и многоомные подходы
- scRNA‑seq + scATAC‑seq + (scBS‑seq/scRRBS) для отслеживания траекторий и вариабельности; позволяет связать эпигенетический статус отдельных клеток с их судьбой.
6. Функциональные исходы
- Биологические ассайи: маркеры дифференцировки (мРНК/белок), потенциал к колониеобразованию, in vitro‑дифференцировка, формирование органоидов, тератомы/вклад в эмбрион (для эмбриональных стволовых клеток) — нужны для демонстрации биологической релевантности.
Ключевые измерения/методы (что проверять)
- ДНК‑метилирование: бисульфит‑секвенирование (WGBS/BS‑seq), целевые bisulfite; для 5hmC — TAB‑seq или oxBS‑seq.
- Гистоны: ChIP‑seq, CUT&RUN/CUT&Tag для H3K4me3, H3K27me3, H3K27ac и др.
- Хроматиновая доступность: ATAC‑seq.
- Транскрипция: bulk/scRNA‑seq, qPCR для ключевых генов.
- Функция: маркеры линий, морфология, функциональные тесты выше.
Критерии строгой причинности (рекомендовано)
- Специфичность: локус‑специфичное изменение даёт ожидаемый фенотип; не‑специфичные вмешательства подтверждаются локусными тестами.
- Последовательность: эпигенетическое изменение предшествует изменению экспрессии и фенотипа.
- Обратимость/резюме: возврат эпигенетического состояния (или экспрессии) восстанавливает исходный фенотип.
- Множественные независимые методы: генетика, эпигеномная редакция, фармакология, и конвергенция данных омникс.
Примерные доказательные пары (коротко)
- dCas9‑TET на энхансер генa X → потеря метилирования, повышение mRNA X, рост дифференцировки в линию Y; нефункциональный dCas9‑TET контроль — нет эффекта.
- DNMT3A KO стволовых клеток → неэффективное подавление плюрипотентных генов → блокировка дифференцировки; восстановление DNMT3A или таргетное обновление метилирования восстанавливает дифференцировку.
Вывод одним выражением:
$\text{вмешательство в энзим эпигенетической модификации}\Rightarrow \text{изменение метилирования/гистонов}\Rightarrow \text{изменение экспрессии}\Rightarrow \text{изменение дифференцировки}$.
Если нужно, могу предложить конкретный план эксперимента высокого уровня для вашей модели стволовых клеток (какие измерения и контролы включить).