Кратко — как влияет и как проверить.
Возможные молекулярные и клеточные последствия:
- Изменение структуры белка: исключение/включение экзона может привести к утрате/появлению функционального домена, сайтов связывания, сигнала локализации или трансмембранного участка → потеря/изменение функции или новая функция (gain/loss-of-function).
- Изменение рамки считывания → преждевременный стоп-код → деградация мРНК через NMD или укороченный белок с аномальной активностью.
- Изменение стабильности или местоположения белка → изменение уровней, деградация, неправильная локализация (ядерная/цитоплазматическая/мембранная).
- Изменение взаимодействий (нарушение комплексов, доминирующий-отрицательный эффект).
- Воздействие на пути сигнальной передачи, клеточный цикл, апоптоз, метаболизм и т.д. — в зависимости от функции исходного белка.
Как проверить — приоритетный экспериментальный план (минимально до исчерпывающих тестов):
(1) Биокомпьютерные предсказания
- Оценить влияние мутации на сайты сплайсинга (SpliceAI, MaxEntScan) и предсказать новый экзон/шифт рамки.
- Проанализировать изменение доменов/сигналов (Pfam, PROSITE), предсказание ТМ/локализации.
(2) Проверка на уровне РНК
- RT-PCR с праймерами, окружающими изменённый регион — распознать новые размеры ампликонов; Sanger‑секвенирование кДНК для подтверждения последовательности.
- Количественная оценка: qPCR или RNA‑seq для определения доли нового изоформа (splicing percent spliced in, PSI). Ожидаемое изменение значимо при уровне, например, $\ge 2$-кратном с p‑value $<0.05$.
(3) Проверка на уровне белка
- Вестерн-блот с антителом, распознающим консервативный эпитоп (и, если возможно, изоформо-специфичным) — проверить размеры и уровни белка.
- Мас-спектрометрия (LC‑MS/MS) для подтверждения присутствия уникальных пептидов нового изоформа.
(4) Локализация и взаимодействия
- Иммунофлуоресценция/фракционирование для изменения субклеточной локализации.
- Co‑IP или протеомные подходы для изменения белковых взаимодействий.
(5) Функциональные тесты в клетках
- Assay, релевантный функции белка: активность фермента, репортерный анализ сигнального пути, пролиферация, апоптоз, миграция и т.д.
- Экспрессия конструированного здоровья (экзогенный вектор) для сравнения WT vs новый изоформ — rescue/overexpression и knockdown эксперименты; тестировать эффект доминантного‑отрицания.
(6) Проверка на NMD и перевод
- Лечение циклогексимидом (или ингибитором транскрипции) и сравнение уровней мРНК — если мРНК восстанавливается, вероятна NMD.
- Ribosome profiling или полисомные градиенты для доказательства трансляции изоформа.
Контрольные моменты и статистика
- Всегда включать WT и мутацию в одинаковых условиях, технические/биологические реплики ($n\ge 3$).
- Квантифицировать эффекты и тестировать статистически (t‑test, ANOVA в зависимости от дизайна) с отчётом p‑значений и доверительных интервалов.
Краткое резюме: сначала подтвердите изменение сплайсинга на уровне РНК (RT‑PCR, RNA‑seq), затем оцените воздействие на белок (вестерн, MS, локализация) и проведите функциональные тесты и rescue‑эксперименты; используйте in silico‑предсказания и NMD/трансляционные анализы для механистического понимания.