Кратко: микроРНК (miRNA) — короткие некодирующие РНК, которые после биогенеза загружаются в комплекс RISC и связываются с мРНК-мишенями преимущественно по «сид‑последовательности», приводя к репрессии трансляции и/или деградации мРНК. Ниже — сжатое разбор механизмов, примеры в развитии и болезнях и методы исследования.
1) Биогенез и целеуказание
- Прекурсоры: приёмная транскрипция — pri‑miRNA → (Drosha/DGCR8) → pre‑miRNA (≈ $\sim 70$ нуклеотидов) → (Dicer) → зрелая miRNA (≈ $\sim 22$ нуклеотида).
- Загрузка: зрелая miRNA ассоциируется с белком Argonaute (Ago) в составе RISC.
- Распознавание мишеней: критична «seed» зона — нуклеотиды $2\text{–}8$ 5' конца miRNA; комплементарность в этой зоне определяет большинство целевых взаимодействий; вкладываются также 3' доповнения и контекст 3'UTR мРНК.
2) Механизмы посттранскрипционной регуляции
- Репрессия трансляции: RISC мешает инициации и/или удлинению; часто наблюдается быстрая потеря белка при меньших изменениях уровня мРНК.
- Деградация мРНК: RISC привлекает посредников (GW182/TNRC6), активирует деаденилирование (CCR4‑NOT), децapping и последующий 5'→3' распад; в итоге уровень мРНК снижается.
- Хронология: часто сначала фиксируют снижение трансляции, затем — деградацию мРНК; вклад каждого механизма зависит от мишени, клеточного контекста и степени комплементарности.
- Локализация: P‑bodies и другие RNP‑гранулы — центры хранения/деградации регуляторных комплексов.
- Доп. механизмы: miRNA могут стабилизировать некоторые мРНК, действовать в ядерных путях (регуляция сплайсинга/транскрипции), выступать как ceRNA‑сети (конкурирующие эндогенные РФНК, «sponges»).
3) Примеры роли в развитии и болезнях
- Развитие:
- lin‑4 и let‑7 (C. elegans): первые описанные miRNA, регулируют временные программы развития.
- miR‑1: контроль миогенеза и сердечной функции; влияет на транскрипционные факторы и каналы.
- miR‑124: нейрональная дифференцировка, подавляет некрональные программы генов.
- Рак:
- onco‑miR: miR‑21 повышен во многих опухолях; подавляет опухолевые супрессоры (PTEN, PDCD4).
- опухолевые супрессоры: let‑7 подавляет онкогены (RAS); потеря let‑7 связана с прогрессированием.
- Кардиологические заболевания:
- miR‑208, miR‑133, miR‑1 регулируют гипертрофию, ремоделирование и аритмии.
- Инфекции и метаболизм:
- miR‑122: печёночная miRNA, важна для жизненного цикла HCV и регулирования липидного обмена; ингибирование miR‑122 снижает вирусную репликацию.
- Неврологические болезни:
- дисбаланс miR‑9, miR‑124 и других ассоциирован с нейродегенерацией и психиатрическими расстройствами.
4) Методы экспериментального исследования функций miRNA
- Профилирование и количественная оценка:
- small RNA‑seq: глобальный профиль miRNA; даёт относительные уровни и новые последовательности.
- qRT‑PCR (stem‑loop primers) и Northern blot — подтверждение отдельных miRNA.
- Манипуляции уровней:
- мимики (miRNA mimics) для overexpression; антагонисты (antagomirs), LNA‑антагонисты, спонжи (sponge) или Tough Decoy для ингибирования.
- генетическое удаление/мутация: CRISPR/Cas9 (удаление локуса), кондициональные KO Dicer/Drosha для оценки глобальных эффектов.
- Идентификация прямых мишеней:
- Luciferase‑репортеры с 3'UTR (и с мутациями сид‑сайта) — классическая валидация.
- Ago‑иммунопреципитация (Ago‑IP) ± последующий RNA‑seq (RIP‑seq) — обогащённые мРНК‑мишени.
- CLIP‑технологии: HITS‑CLIP, PAR‑CLIP, iCLIP — высокоточное картирование взаимодействий Ago‑RNA in vivo.
- Функциональные эффекты:
- RNA‑seq/Proteomics после манипуляции уровнем miRNA — оценка регуляторного воздействия на транскриптом и протеом.
- Ribosome profiling (Ribo‑seq) и полисомный анализ — различить репрессию трансляции от деградации.
- Фенотипические модели: клеточные (дифференцировка, пролиферация, апоптоз) и животные модели (транзгенные/KO) для in vivo эффекта.
- Контроль специфичности и арифметика эффектов:
- использовать несколько независимых подходов (antagomir vs KO), rescue‑эксперименты (введение резистентной мРНК или miRNA), тестировать мутантные сид‑сайты.
- учитывать off‑target эффекты и дозозависимость; сочетать транскриптомику и протеомику для полной картины.
5) Ограничения и рекомендации
- Один miRNA имеет обычно много мишеней, эффект на каждую мРНК часто умеренный (умножающийся по сети).
- Предсказания in silico (TargetScan, miRanda и др.) дают гипотезы, но требуют экспериментальной валидации.
- Комбинация CLIP + RNA‑seq + Ribo‑seq + функциональные тесты даёт наиболее надёжное заключение о роли miRNA в конкретном контексте.
Короткое заключение: miRNA регулируют посттранскрипционно путем подавления трансляции и/или деградации мРНК через RISC; они критически важны в развитии и патологиях (рак, сердце, печень, нервная система). Для изучения используют комбинацию экспресс‑анализа, манипуляций уровнем miRNA, таргет‑валидации (репортеры, CLIP) и омics‑методов для комплексной интерпретации.