Кратко — как и чем доказывать.
Механизмы, приводящие к разным фенотипам
1. Изменение структуры белка: альтернативный сплайсинг удаляет/вставляет экзоны, меняет доменные модули → утрата/появление активности, изменения взаимодействий, стабилизации.
2. Изменение локализации: включение/исключение сигналов локализации (NLS, сигнальный пептид, TM‑домены) меняет куда белок попадает в клетке.
3. Доминирующий‑отрицательный или нео‑функциональный эффект: короткий изоформ может блокировать функцию основного (компетитивное связывание).
4. Регуляция уровней через NMD: изоформа с PTC (premature termination codon) уходит под NMD → меняется суммарный уровень белка.
5. Промежуточные регуляторные РНК‑эффекты: альтернативные 5'/3' UTR меняют стабильность и трансляцию (miRNA‑мишени).
6. Клеточно‑/тканевая и условная экспрессия: разные ткани, стадии развития или стимулы дают разные наборы изоформ — разные фенотипы в разных контекстах.
Ключевые признаки, которые нужно проверить: изменение открытой рамки/деление доменов, изменение локализации, изменение экспрессии/стабильности, переводимость изоформ, корреляция изоформ ↔ фенотип.
Экспериментальные подходы (что делать и что покажет)
A. Обнаружение и количественная оценка транскриптов
- Короткочтение RNA‑seq + инструменты для квантования изоформ (Kallisto/Salmon/RSEM) — выявляет экспрессию и относительные доли изоформ; вычисление PSI: $\Psi =\frac{{\text{reads}}_{\text{inclusion}}}{{\text{reads}}_{\text{inclusion}}+{\text{reads}}_{\text{skipping}}}$.
- Длинночтение (PacBio Iso‑Seq, Oxford Nanopore) — показывает полные последовательности транскриптов, сплайсинг‑конфигурации.
- single‑cell RNA‑seq — определяет клеточные субпопуляции с разными изоформами.
B. Валидация транскриптов
- RT‑PCR / Sanger с изоформо‑специфичными праймерами; qPCR для количеств.
- in situ hybridization / RNAscope с изоформо‑специфичными зондами — пространственная экспрессия.
C. Доказательство трансляции и наличия белка
- Ранние: Western blot с изоформо‑специфичными антителами.
- Масс‑спектрометрия (shotgun; targeted SRM/MRM) для идентификации пептидов, уникальных для изоформ.
- Рибосомный профиль (Ribo‑seq) — подтверждает, какие изоформы переводятся.
D. Функциональные тесты (критичные для причинно‑следственной связи)
- Модуляция сплайсинга:
- Antisense oligonucleotides (ASO) / splice‑switching oligos — переключить включение/исключение экзона и смотреть фенотип.
- CRISPR/Cas9: мутировать сплайс‑сайты, удалить/вставить регуляторные элементы, создать knock‑in конкретной изоформы.
- Минеген‑репортеры: вставить участок гена с интрон/экзон → тестировать влияние мутаций/факторов на сплайсинг.
- Rescue‑эксперименты: удалить все изоформы (knockout), потом рекомбинантно экспрессировать одну‑по‑одной и оценивать восстановление фенотипа.
E. Механизмы регуляции
- CLIP‑seq/eCLIP/iCLIP для выявления белков‑регуляторов сплайсинга (RBPs) и их сайтов.
- Манипуляции уровней RBPs (RNAi/CRISPRa/i) и наблюдение сдвигов сплайсинга и фенотипа.
F. NMD‑проверка
- Блокировать NMD (cycloheximide, UPF1 KD) — повышение уровня подозрительной изоформы укажет на её деградацию через NMD.
Рекомендуемый экспериментальный pipeline (минимум для доказательства причинности)
1. Корреляция: RNA‑seq/long‑read + количественная оценка изоформ в состояниях/тканях с разным фенотипом.
2. Валидация: RT‑PCR/qPCR, Sanger, in situ.
3. Белок: western/MS, Ribo‑seq.
4. Манипуляция сплайсинга (ASO или CRISPR) → наблюдение изменения фенотипа.
5. Rescue: экспрессировать только одну изоформу в фоне удаления → восстановление/не восстановление фенотипа подтверждает функциональную роль.
6. Механистика: CLIP, минеген, проверка NMD, локализации (IF), взаимодействий.
Коротко: сочетайте корреляционные данные (RNA‑seq, long‑read) с функциональными вмешательствами (ASO/CRISPR + rescue) и подтверждением на белковом уровне (MS/Western) — это обеспечивает надёжное доказательство, что альтернативный сплайсинг вызывает различия в фенотипе.