Ожидаемые эффекты (что произойдёт при подавлении гена, участвующего в синтезе/сборке клеточной стенки)
- Морфология: потеря типичной формы (палочки → округление/сферы; образование выпячиваний/буллов; локальные выпи‑чивания в местах ослабления стенки); у бактерий с делением на септуме — задержка/дефект септа‑ции → удлинение/филаментация; тонкая или отсутствующая пептидогликановая оболочка, неровная поверхность.
- Жизнеспособность: повышенная чувствительность к осмотическому шоку и лизису, снижение роста (OD и/или CFU), уменьшение жизнеспособных клеток; повышенная чувствительность к лизирующим агентам и антибиотикам, действующим на клеточную стенку.
Микроскопическое подтверждение (методы и ожидаемые признаки)
- Фазово‑контрастная/DIC‑микроскопия: изменение формы, выпячивания, разрывы/лизис в реальном времени; тайм‑лапс для наблюдения лизиса.
- Флуоресцентная микроскопия:
- флуоресцентные D‑аминокислоты (FDAA, напр. HADA/NADA): уменьшение или изменение распределения метки нового пептидогликана (меньше инкорпорации в местах роста);
- метки стенки (WGA‑Alexa для GlcNAc, флуорованкомицин Van‑FL): снижение интенсивности или перераспределение покраски;
- красители мембраны (FM4‑64) + окраска пропидием/ SYTO9 (Live/Dead): сохранение мембраны при утрате стенки или наоборот — пропидий проникает при потере целостности → рост доли мёртвых клеток.
- Электронная микроскопия (TEM/SEM): тонкая или отсутствующая пептидогликановая прослойка, изменение толщины стенки в TEM; структурные дефекты поверхности в SEM.
- Квантитативно: подсчёт процентов клеток с дефектами, доля PI‑позитивных клеток, снижение интенсивности FDAA/Van‑FL на клетку.
Биохимическое подтверждение (методы и ожидаемые изменения)
- Измерение роста и жизнеспособности: кривая роста (OD600) + подсчёт CFU — расхождение (OD может оставаться, но CFU падает) → свидетельство потери жизнеспособности.
- Инкорпорация предшественников пептидогликана: снижение включения радиолабелированных или флуоро‑D‑аминокислот (напр., уменьшение сигнала FDAA или снижение радиального включения ${}^3$H/ ${}^{14}$C‑маркеров). (Если используете числа — рассчитывайте относительное снижение.)
- Изоляция саккула и разложение муреопептидов с последующим HPLC/UPLC/MS‑анализом: уменьшение общего количества муреопептидов, изменение профиля (снижение сшивки, накопление прекурсоров).
- Автолизные тесты: Triton X‑100 или осмотическая лизис‑проба — повышенная скорость автолиза (ускоренное падение OD при добавлении тритона/лизоцима).
- Чувствительность к антибиотикам и лизирующим ферментам: снижение MIC к лизирующим агентам или повышение чувствительности к β‑лактамам/лизоциму — косвенное подтверждение ослабленной стенки.
- Белковый/транскрипционный контроль: qRT‑PCR и/или Western blot — подтверждение снижения экспрессии мишени транскрипционного репрессора; восстановление фенотипа при комплементировании плазмидой подтверждает специфичность.
Контрольные эксперименты и рекомендации
- Параллельно: дикий тип, рекомбинантный восстановленный штамм (комплементирование), пустой вектор.
- Осмопротективные условия (например среда с осмопротектором) — если осмоза предотвращает лизис, это подтверждает дефект стенки.
- Комбинация микроскопии и количественных биохимических данных (например снижение FDAA‑инкорпорации + изменение профиля муреопептидов + увеличение PI‑позитивных клеток) даёт надёжное доказательство роли гена в формировании клеточной стенки.
Кратко: ожидайте потерю формы, выпячивания и лизис, снижение жизнеспособности; подтвердите визуально (фазовый контраст, FDAA, Van‑FL, TEM) и количественно (инкорпорация предшественников, анализ муреопептидов, автолиз/CFU/Live‑Dead).